新疆葡萄枝孢果腐病病原菌的鉴定及生物学特性

陈思颖, 焦瑞莲, 李志强, 刘 政*, 李国英*

(1. 石河子大学农学院,新疆绿洲农业病虫害治理与植保资源利用重点实验室, 石河子 832003; 2. 新疆石河子开发区石大惠农科技开发有限公司, 石河子 832003)

我国是世界葡萄与葡萄酒生产大国,其中鲜食葡萄种植面积、产量均居世界第一位[1]。据国家统计局网站数据显示,2019年,新疆葡萄产量为313.17万t,占我国葡萄总产量的22.06%,成为全国最大的葡萄生产基地。2019年,在新疆石河子发现一种葡萄果实新病害,多发生在有伤口的成熟葡萄果实上,病部常形成橄榄绿色霉层,受害部位通常凹陷,最后失水皱缩干枯，易脱落,严重影响葡萄的品质。挑取葡萄病部橄榄绿色霉层在光学显微镜下观察发现大量枝孢菌分生孢子。

枝孢菌广泛分布于空气、土壤、食品、水体中,可作为病原菌侵染多种作物,如辣椒[2]、柚[3]、葡萄[4-8]和棉花[9]等,少数种还可侵染动物和人类[10-13]。关于葡萄枝孢菌的研究,Briceo等[5]从智利山谷‘赤霞珠’葡萄上分离到枝孢菌,并将其鉴定为枝状枝孢Cladosporiumcladosporioides和多主枝孢C.herbarum。2003年,Gabler等[6]发现葡萄品种的感病性和果皮的完整性对病菌的侵染有重要的影响。1992年,张国敏等[7]在我国首次发现枝孢菌危害葡萄果实,但未进行种的鉴定。随后,翟凤艳等[8]从葡萄叶片上也分离到绿色枝孢C.viride。目前在新疆未见枝孢菌危害葡萄果实的报道。本研究通过形态学鉴定、分子生物学鉴定和致病性测定,确定了危害新疆葡萄果实的枝孢菌种类,并对其生物学特性进行了初步研究。

1 材料与方法

1.1 病害调查及病样采集

2019年8月底到9月上旬,在石河子地区葡萄园的‘无核紫’葡萄上,发生了一种严重的烂果病,经检查病部表面有不少枝孢属Cladosporium真菌的分生孢子。为进一步查明病害的发生情况,2020年9月上中旬,对南北疆11个葡萄园的枝孢果腐病进行了调查,记录该病的典型症状,同时采集症状典型的病样,供后续研究。

1.2 病原菌的分离、纯化及代表菌株的选择

采用常规稀释分离法,对采集的病样在马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)上进行病原分离和单孢纯化,根据采集地点、葡萄品种、菌落形态、生长速度等选取代表性菌株,PDA试管斜面4℃保存,供后续试验。

1.3 病原菌鉴定

1.3.1形态学鉴定

分离纯化的21个代表性菌株接种在PDA培养基后,将无菌的盖玻片以45°角斜插入培养基中(与接种菌块距离为1.0～1.5 cm),在25℃条件下倒置培养5 d,待菌丝长过插片的位置后取出玻片,观察分生孢子梗和分生孢子着生方式,并测量50个分生孢子大小;用扫描电子显微镜(日本HITACHI SU8010,加速电压5 kV,工作距离8 mm)对枝孢菌独特的孢痕结构、分生孢子梗和分生孢子表面纹饰进行观察并拍照。按Bensch等[14]的方法进行形态鉴定。

1.3.2分子生物学鉴定

将纯化后的21个供试菌株在PDA上,25℃培养10 d后用无菌刀片刮取菌丝体置于2 mL离心管中,用Biospin Fungus Genomic DNA Extraction Kit(杭州博日科技有限公司)提取DNA。采用真菌ITS1和ITS4、编码肌动蛋白基因的ACT-512F和ACT-783R以及编码翻译延长因子基因的TEF1-728F和TEF1-986R为引物对试验菌株基因组DNA进行PCR扩增[15-16]。扩增产物用1%琼脂糖凝胶(rDNA-ITS)和2%琼脂糖凝胶(ACT、TEF1-α)电泳检测后,将PCR产物连接至测序载体pMD 19-T上,送至生工生物工程(上海)股份有限公司测序。获得的序列在NCBI数据库中进行BLAST比对,选取枝孢属不同种同源性较高序列,利用软件DNAMAN进行比对分析。以甜菜生尾孢Cercosporabeticola(ITS、TEF1-α和ACT登录号分别是AY840527、AY840494和AY840458)作为外群,用MEGA 7.0软件采用最大似然法进行系统发育树的构建,确定其分类地位。

1.4 致病性测定

用分生孢子悬浮液喷雾接种和菌丝球接种两种方法进行致病性测定。试验选用从葡萄园采摘的‘新郁’葡萄果实,用75%乙醇对其表面进行消毒,再用无菌水冲洗3次,置于灭菌吸水纸上晾干,用小型无菌注射器针头将果面轻微刺伤。

分生孢子悬浮液喷雾接种:以不针刺喷雾清水和针刺后喷雾清水作为对照,用浓度为1×107个/mL的孢子悬浮液进行喷雾接种,均匀喷雾3次以使果面完全湿润。每个处理10粒葡萄,3次重复,保湿培养,每3 d观察1次,记录发病情况。对发病葡萄进行病原菌分离,观察分离菌株与接种菌株异同。

菌丝球接种:打取5 mm直径菌饼放入马铃薯液体培养基中,置于25℃摇床150 r/min培养2 d。用移液枪吸取大小一致的单个菌丝球置于果面的刺伤部位,并以不放置菌丝球为对照,保湿培养7 d后去除菌丝球,每个处理10粒葡萄,3次重复,7 d后记录发病情况,并对发病果面进行再分离,观察菌株与接种菌株的异同。

1.5 生物学特性测定

根据形态学和分子生物学鉴定结果,选择C4和C10分别代表枝状枝孢C.cladosporioides和柠檬形枝孢C.limoniforme,进行以下生物学特性的研究。枝孢菌产孢量大,用菌饼转接极易在培养基上形成较多小菌落,因此生物学特性试验采用菌丝球接种。

1.5.1温度对枝孢菌生长和产孢量的影响

吸取大小一致的单个菌丝球(菌丝球获得同1.4)转接到PDA培养基上,分别置于5、10、15、20、25、30、35℃的培养箱中,黑暗恒温培养。每组处理3个重复。14 d后测量菌落直径并拍照,之后在菌落半径的1/2处打取5 mm的菌饼,取2个菌饼置于2 mL离心管中,加入1 mL无菌水,充分振荡,得到分生孢子悬浮液(下同)。然后按常规血球板计数法测定每个温度下的产孢量,3次重复,求其平均值。

1.5.2光照对枝孢菌生长和产孢量的影响

将菌丝球转接到PDA培养基上,分别置于完全光照(24 h光照)、完全黑暗(24 h黑暗)和光暗交替(L∥D=12 h∥12 h)3种处理的培养箱中,25℃培养14 d,测量菌落直径,每组处理3个重复。产孢量的测定方法同1.5.1。培养皿距离光源25 cm,光照强度为5 000 lx。

1.5.3pH对枝孢菌生长和产孢量的影响

用HCl和NaOH将PDA培养基的pH分别调节为4、5、6、7、8、9、10后灭菌,然后在无菌条件下,将菌丝球置于上述不同pH的PDA培养基上,25℃黑暗培养14 d,测量菌落直径,每组处理3个重复。产孢量测定方法同1.5.1。

1.5.4枝孢菌的致死温度测定

设置水浴锅温度为40、45、50、55、60、65、70℃,将装有1mL浓度为1×107个/mL的孢子悬浮液的离心管和装有2个5 mm菌饼的离心管分别置于不同供试温度的水浴锅中处理10 min,取出冷却至室温后接种至PDA平板上,25℃黑暗培养5 d,根据PDA平板上是否有菌落生长确定其致死温度的范围,再以1℃为温度梯度重复上述步骤,连续进行4次,确定其致死温度。

1.6 数据分析

用Excel 2010进行试验数据分析,用 SPSS 19.0对数据进行多重比较和方差分析。

2 结果与分析

2.1 田间调查采样及症状描述

田间调查发现,葡萄枝孢果腐病在11个调查的葡萄园中均有发生,范围较广,霉层多出现在有伤口的成熟葡萄果粒上。该病一般在8月下旬葡萄成熟后发生,特别在虫害较多、裂果较重、或存在伤口的果实上发生较多。受害部位通常凹陷,最初病斑为近圆形小点,后扩展至整个伤口,并在病部形成橄榄绿至褐绿色霉层,严重时导致整个果粒干枯。

2.2 病原菌的分离、纯化及代表菌株的选择

调查中共采集典型症状病样80个,经分离共得到91个菌株。根据采集地点、葡萄品种、菌落生长速度等特点,选取代表性菌株21个,具体采样地点和品种见表2。

表2 21个代表菌株的来源及相关信息Table 2 The origin and related information of 21 representative strains

2.3 病原菌鉴定

2.3.1形态学鉴定

供试21个菌株在PDA上25℃培养14 d后,菌落正面均呈深绿色或橄榄绿色,背面呈墨绿色;菌落呈绒毛状或毡状,菌丝有分隔,光滑或粗糙。光学显微镜下可见分生孢子梗单生,直立,有隔;分生孢子链状,通常有多个分支,簇生或单生,有隔或无隔。分生孢子具有明显帽(冠)状结构的孢痕(图1a4, 图1b4)。根据菌落生长速度、分生孢子形状、大小、表面纹饰将菌株分为两类。

第一类:共20个菌株,在PDA培养基上生长较快,14 d后菌落直径为52.5～72.0 mm。初期菌落正面为橄榄绿色,背面为墨绿色,边缘白色至无色透明;后期菌落正面颜色由内至外呈绿色至灰绿色,培养基背面龟裂。菌落紧密呈绒毛状,伴有同心轮纹。分生孢子梗直立或弯曲,单生,有隔,大小(41.36～269.76)μm×(3.27～5.84)μm。分生孢子多链生或单生,无隔或有隔,一般每链5～7个分生孢子,最多8个分生孢子。分枝分生孢子圆柱形、近卵圆形,大小(8.78～28.66)μm×(2.55～4.58)μm;次级分枝分生孢子卵圆形、长椭圆形,大小(4.70～14.92)μm×(1.57～4.73)μm;中间分生孢子卵圆形、纺锤形,大小(4.57～10.11)μm×(2.57～4.38)μm;末端分生孢子卵圆形、近圆形,大小(2.90～8.19)μm×(1.69～3.50)μm。在扫描电镜下,可观察到分生孢子表面具有不规则网状纹,其形态特征与枝状枝孢Cladosporiumcladosporioides一致(图1：a1～a4)。

图1 引起葡萄枝孢果腐病的两种菌株的形态特征Fig.1 Morphological characteristics of two cladosporium strains causing grape fruits rot

第二类:只有1个C10菌株,在PDA培养基上生长较慢,14 d后菌落直径为(32.4±5.5)mm。初期菌落正面为黄绿色,背面墨绿色,边缘白色;后期菌落黄褐色,表面产生褶皱,培养基背面龟裂;菌落紧密为毛毡状。分生孢子梗单生,有隔,大小(42.51～265.71)μm×(2.73～6.17)μm。分生孢子有隔或无隔,多链生或单生,一般每链5～7个分生孢子,最多8个分生孢子。分枝分生孢子椭圆形、长梭形,大小(7.73～23.51)μm×(2.28～5.37)μm;次级分枝分生孢子长梭形、长卵圆形,大小(4.85～15.19)μm×(2.35～4.65)μm;中间分生孢子卵圆形、柠檬形,大小(4.43～9.74)μm×(2.51～4.15)μm;末端分生孢子卵圆形、圆形,大小(3.50～8.89)μm×(1.83～3.81)μm。在扫描电镜下,可观察到分生孢子表面具有倒钩状或刺状突起,其形态特征与柠檬形枝孢Cladosporiumlimoniforme一致(图1：b1～b4)。

2.3.2分子生物学鉴定

真菌通用引物ITS1/ITS4扩增得到第一类菌株(C1～C9、C11～C21)片段大小为520 bp,在NCBI中BLAST比对结果显示,与枝状枝孢Cladosporiumcladosporioides(登录号MH863917.1)、极细枝孢C.anthropophilum(登录号MF472922.1)、瓜枝孢C.cucumerinum(登录号HM148078.1)相似性分别为99.42%、98.80%、98.20%;第二类菌株(C10)扩增产物为520 bp,与柠檬形枝孢Cladosporiumlimoniforme(登录号KT600400.1)、枝细枝孢(登录号EF679384.1)相似性分别为99.56%、99.12%。

肌动蛋白基因引物ACT-512F/ACT-783R扩增得到第一类菌株(C1～C9、C11～C21)产物为198 bp,与枝状枝孢(登录号HM148516)、极细枝孢(登录号MF473348.1)相似性分别达到98.24%、88.83%;第二类菌株(C10)扩增产物为197 bp,与柠檬形枝孢(登录号KT600595.1)、多主枝孢C.herbarum(登录号EF679521.1)相似性分别达到100%和84.21%。

翻译延长因子引物TEF1-728F/TEF1-986R扩增得到第一类菌株(C1～C9、C11～C21)产物为215 bp,与枝状枝孢(登录号HM148244)相似性达到97.32%;第二类菌株(C10)扩增产物为210 bp,与柠檬形枝孢(登录号KT600497.1)相似性达到97.49%。

对供试菌株进行多基因联合系统发育分析,结果显示第一类20个菌株,即C1～C9和C11～C21分别在两个分支上,但均与枝状枝孢聚在一起;第二类菌株C10与柠檬形枝孢聚在一起,形成一个分支;外群菌株甜菜生尾孢Cercosporabeticola与枝孢属真菌分为两个分支(图2)。

图2 基于 rDNA-ITS、TEF1-α、ACT 联合序列的葡萄枝孢果腐病病原菌及相似种的系统发育分析Fig.2 Phylogenetic tree analysis of cladosporium strains causing grape fruits rot and closely related species based on concatenated sequences of rDNA-ITS， TEF1-α， ACT

根据病原菌的形态特征及多基因联合系统发育分析,确定分离到的菌株均为枝孢属Cladosporium,有2个种,分别是枝状枝孢和柠檬形枝孢,其中枝状枝孢占供试菌株的95.2%,为优势种。

2.4 致病性测定

根据形态学和分子生物学鉴定结果选择代表菌株C4和C10进行致病性测定。无伤接种,孢子悬浮液喷雾接种和菌丝球接种均不发病。采用有伤(针刺)接种,用孢子悬浮液和菌丝球接种均可使葡萄果实发病,一开始在伤口处出现淡色小点,后斑点逐渐扩大并出现橄榄绿色霉层。菌丝球接种(图3f,g)比孢子悬浮液接种(图3d,e)发病更快,症状也更为明显;接种症状与田间发病症状一致(图3a)。从接种发病后的病斑处再分离病原菌,分离到与接种所用菌株相同的菌株。

图3 两种枝孢菌接种成熟葡萄后引起的症状与成熟期自然发病症状Fig.3 Symptoms on mature grapes after inoculation with two Cladosporium species and natural symptoms at mature stage

2.5 两种枝孢菌的生物学特性

2.5.1温度对两种枝孢菌生长和产孢量的影响

结果(表3)表明,在相同温度条件下枝状枝孢的生长均明显快于柠檬形枝孢;但两种菌对温度的反应基本一致,即在10～30℃均可生长,在5℃和35℃时生长极为缓慢,培养14 d菌落直径不足5 mm(接到培养基上的菌丝球直径为2 mm)。其最适生长温度为25℃,在25℃培养14 d,两种枝孢菌的菌落直径可分别达到(52.2±0.1) mm和(31.7±0.1) mm。

表3 温度对两种枝孢菌菌落生长和产孢量的影响1)Table 3 Effects of temperature on colony growth and sporulation capacity of two Cladosporium species

温度对两种菌产孢量的影响与对菌落生长的影响基本相同,均以25℃下产孢量最大,枝状枝孢产孢量(7.38±0.11)×103个/mm2,柠檬形枝孢产孢量(6.14±0.13)×103个/mm2;其次为20℃和15℃,再次为30℃,10℃产孢量明显减少,5℃和35℃时由于菌落基本不生长对产孢量未进行统计。

2.5.2光照对两种枝孢菌生长和产孢量的影响

3种光照条件下都表现为枝状枝孢的生长速度比柠檬形枝孢快，但枝状枝孢的生长对光照不敏感,在不同光照条件下,其生长均没有明显差异;而柠檬形枝孢在不同光暗条件下生长有差异,以完全光照条件下生长最好。光照对枝状枝孢的产孢量影响不大,但柠檬形枝孢在完全黑暗条件下产孢量较多(表4)。

表4 光照对两种枝孢菌菌落生长和产孢量的影响Table 4 Effects of illuminations on colony growth and sporulation capacity of two Cladosporium species

2.5.3pH对两种供试枝孢菌生长和产孢量的影响

结果(表5)表明,两种枝孢菌在pH 4～10条件下均能生长和产孢。枝状枝孢适宜生长和产孢的pH为5～7(偏酸性环境),在pH为5～7时,培养14 d菌落直径可达到(53.0±0.1)mm,当pH=6时,产孢量最大,为(6.46±0.23)×103个/mm2。柠檬形枝孢在pH=7时生长最快,产孢量最大。培养14 d菌落直径可达到(35.8±0.1)mm,产孢量为(4.88±0.21)×103个/mm2。

表5 pH对两种枝孢菌菌落生长和产孢量的影响Table 5 Effects of pH on colony growth and sporulation capacity of two Cladosporium species

2.5.4两种枝孢菌的致死温度

将枝状枝孢孢子悬浮液在52℃水浴锅加热10 min后,孢子不再萌发,确定孢子致死温度为52℃;将装有枝状枝孢菌饼的离心管60℃水浴锅加热10 min后,菌丝不再生长,确定菌丝致死温度为60℃。

将柠檬形枝孢孢子悬浮液在50℃水浴锅加热10 min后,孢子不再萌发,确定孢子致死温度为50℃;将装有柠檬形枝孢菌饼的离心管58℃水浴锅加热10 min后,菌丝不再生长,确定菌丝致死温度为58℃。

3 结论与讨论

2019年9月在新疆石河子地区葡萄果实上发现一种新的果实病害,只在成熟的果实上发现,发病较重。为此2020年8、9月间在葡萄成熟期,对南北疆一些葡萄园进行了普查,发现该病发生比较普遍,但主要在有伤口的成熟果实上出现。该病与Briceo等所报道的智利葡萄枝孢果腐病的发生时期完全一致[5],都是在果实成熟期发生,其优势菌种也相同,都是枝状枝孢,但没分离到多主枝孢,而分离到柠檬形枝孢。我们从葡萄果实上分离的枝孢菌形态与焦瑞莲等报道的3种棉铃枝孢菌中的两个种[9],即枝状枝孢和柠檬形枝孢一致,只是分生孢子的大小有差异,可能与其寄主植物不同有关。值得关注的是,2017年枝孢菌引起的棉铃病害在新疆大发生,而2019年又开始发现葡萄枝孢果腐病,它们之间的关系如何？有待进一步查明。

以形态学鉴定为基础,经分子生物学鉴定和致病性测定,明确了引起新疆葡萄枝孢果腐病的病原有两种,即枝状枝孢C.cladosporioides和柠檬形枝孢C.limoniforme,其中前者占95.2%,后者只占4.8%,枝状枝孢为优势种。据形态观察,枝状枝孢和柠檬形枝孢具有枝孢属共有的明显特征冠状孢痕,在枝状枝孢分生孢子表面有不规则网纹,柠檬形枝孢分生孢子表面有明显的倒钩状或刺状突起,这些特点与Bensch等[14]及焦瑞莲等[9]所描述的分生孢子形态基本一致。

两种枝孢菌的生物学特性研究表明,在相同条件下枝状枝孢的生长速度明显比柠檬形枝孢要快。两者之间相同之处是:它们的适宜生长和产孢温度均为25℃,不同光暗条件下都可产生大量分生孢子。不同处是:光照对枝状枝孢菌落生长的影响不大,但柠檬形枝孢在光照条件下生长较快,在完全黑暗条件下生长最慢。枝状枝孢的适宜生长pH为5～7,柠檬形枝孢适宜生长pH为7。另外两者的致死温度也不同,前者菌丝和分生孢子的致死温度分别为60℃和52℃,后者为58℃和50℃。

接种试验表明,这两种菌都是弱寄生菌,只能从伤口侵入。这和田间调查时,一般害虫为害较重的果园或受到人工及自然伤害的果园病害发生较重的情况是一致的。因此,在葡萄生长发育过程中,采取各种措施减少鸟类虫害和修枝疏果及雨水淋湿等造成的伤口,对预防和控制葡萄枝孢果腐病的发生可能具有重要作用。本研究结果明确了新疆葡萄枝孢果腐病病原菌及其生物学特性,为今后该病害的预测预报、发生规律和防治方法的研究打下基础。