张绿茵,兰为环 ,刘朋 ,李爽,唐海
(1.江苏天士力帝益药业有限公司,天津 300400;2.天士力控股集团有限公司,天津 300400)
米诺膦酸(minodronic acid)化学名为1-羟基-2-{咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基}亚乙基-1, 1-双膦酸,为第三代含氮芳杂环双膦酸盐类药物,米诺膦酸能够抑制破骨细胞法尼焦磷酸合成酶(FPP)的活性,降低骨转换,进而防治骨质疏松,是由日本小野药品工业株式会社和Astellas制药株式会社共同开发,于2009年在日本上市[1-3],临床上常用的为其一水合物,结构式见图1[4]。
图1 米诺膦酸水合物Fig.1 Minodronic acid hydrate
根据米诺膦酸的合成路线[5-6],米诺磷酸是以2-氨基吡啶和反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯为起始原料,经过亲核加成反应制得关键中间体2-(咪唑并[1,2-a]吡啶-3-基)乙酸乙酯,然后再经水解、磷酸化、精制获得米诺膦酸成品。
图2 中间体合成路线Fig.2 Intermediate synthesis route
反应过程中,2-氨基吡啶既是反应物,又具有一定的碱性,在乙腈回流的高温下,随着产物的生成,也产生了水,通过浓缩除溶剂得到该中间体,该中间体为油状液体,工艺过程实际操作时,浓缩后就连续进行下一步反应,故最初该中间体没有建立相应的质量标准,仅通过反应过程TLC监控,但由于TLC方法对起始原料的残留不能准确定量,造成后续反应较难除去,影响最终产品质量,故此文建立了一个更加有效监测该中间体的GC的方法。
7890A型气相色谱仪(安捷伦科技有限公司);XS105型DU电子分析天平(梅特勒-托利多国际有限公司);Agilent DB-624(30 m×0.320 mm,1.8 µm)毛细管柱,FID检测器;
甲醇(批号,109845077849,HPLC级),购自默克公司;乙腈(批号:JA076630,HPLC级),购自默克公司;2-氨基吡啶(批号:20190312,99.96%),购自安徽星宇化工有限公司;反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯(批号:MN-01-181201,97.31%),购自北京海步医药科技有限公司;中间体1(批号:MN1905241a、MN1905242a、MN1905243a),自制;
以6%氰丙基苯基-94%二甲基聚硅氧烷为固定相的毛细管为色谱柱,起始温度为40 ℃,保持5 min,以25 ℃/min的速率升温至180 ℃,再以40 ℃/min的速率升温至240 ℃,保持10 min;检测器为氢火焰离子化检测器,检测器温度260 ℃,进样口温度180 ℃;以氮气为载气,流速为1.5 mL/min,分流比为10∶1;进样体积1 µL。
2.2.1 空白溶液
甲醇作为空白溶液。
2.2.2 对照品溶液
取乙腈、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯、2-氨基吡啶各适量,精密称定,用甲醇定量稀释制成每1 mL中分别约含0.5 mg、0.025 mg、0.25 mg的混合溶液。
2.2.3 供试品溶液
取中间体1适量,精密称定至量瓶中,加入甲醇定量稀释制成每1 mL中约含5 mg的溶液;
取2-氨基吡啶对照品约25 mg,精密称定,置25 mL量瓶中,用溶剂溶解并稀释至刻度,摇匀,作为2-氨基吡啶定位溶液;取反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯对照品约25 mg,精密称定,置50 mL量瓶中,用溶剂溶解稀释至刻度,摇匀,作为反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯定位溶液;取乙腈约20 mg,精密称定,置10 mL量瓶中,用溶剂溶解稀释至刻度,摇匀,作为乙腈定位溶液;取上述2-氨基吡啶定位溶液、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯定位溶液、乙腈定位溶液及2.2项下空白溶剂、供试品溶液、对照品溶液按照2.1项下的色谱条件进行测定,记录色谱图,结果如图3所示。结果表明空白溶液不干扰测定,各组分之间分离度均大于1.5,说明该检测方法专属性好。见图3。
图3 气相色谱图(1:乙腈; 2:反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯; 3:2-氨基吡啶)Fig.3 Gas chromatogram (1:acetonitrile; 2:ethyl trans-4-oxo-2-butenoate; 3:2-aminopyridine)
取2.3项下的反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯定位溶液,逐步稀释,按照2.1项下的色谱条件进行测定,其中检测限溶液测定3次,定量限溶液测定6次,分别记录反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯峰的信噪比(S/N)平均值。以信噪比大于3∶1时测得的浓度为检测限,以信噪比大于10∶1时测得的浓度为定量限。方法考察的检测限和定量限溶液浓度分别为为0.68 µg/ mL和2.72 µg/mL,分别相当于供试品溶液浓度水平0.01%和0.05% 。
精密称取反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯对照品、乙腈与2-氨基吡啶各适量,加甲醇稀释制成系列浓度的混合线性溶液,依次进样,各三针,按照2.1项下的色谱条件进行测定,记录色谱图,考察各组分浓度与峰面积的线性关系,并以峰面积为纵坐标,浓度为横坐标,用最小二乘法计算线性回归图,结果表明乙腈在0.25 ~ 1.52 mg/mL浓度范围内线性关系良好,线性方程为y= 737.613 5x- 7.246 9,R2= 0.999 9;反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯在0.01 ~ 0.08 mg/mL浓度范围内线性关系良好,线性方程为y= 296.105 9x+ 3.264 7,R2= 0.981 3;2-氨基吡啶在0.13 ~ 0.78 mg/mL浓度范围内线性关系良好,线性方程为y= 1 065.328 8x- 1.541 3,R2= 0.999 9。说明该方法在规定的质量浓度范围内线性关系良好。
分别精密称取乙腈、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯与2-氨基吡啶各适量,加甲醇稀释制成每1 mL约含乙腈2.5 mg、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯0.125 mg、2-氨基吡啶1.25 mg的混合储备液。
按2.2.3项下供试品溶液的配制方法平行配制供试品溶液2份,作为空白供试品溶液;
精密称取供试品(中间体1)约250 mg,称取9份,分成3组,每组分别精密加入混合储备液适量,用溶剂稀释至刻度,制成各限度浓度80%、100%和120%的供试品溶液各3份,共9份,摇匀即得,按照2.1项下的色谱条件进行测定,记录色谱图,计算回收率。结果如表1所示,结果表明该方法的准确度较高,适用于米诺膦酸中间体中乙腈、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯及2-氨基吡啶的检查。
表1 回收率试验结果Tab.1 The results of recoveries(n=9)
(续表)
2.7.1 仪器精密度实验
取2.2.1项下对照品溶液,连续进样6针,按照2.1项下的色谱条件进行测定,记录色谱图,乙腈出峰时间RSD为0.028%,峰面积RSD为0.38%;反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯出峰时间RSD为0.004 5%,峰面积RSD为1.0%;2-氨基吡啶出峰时间RSD为0.004 6%,峰面积RSD为0.38%。仪器精密度良好。
2.7.2 方法精密度实验
按2.2.3项下供试品溶液的配制方法平行配制供试品溶液6份,同时配制对照品溶液2份,按照2.1项下的色谱条件进行测定,记录色谱图,6份供试品溶液中乙腈含量RSD为2.8%,反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量RSD为2.8%,2-氨基吡啶含量RSD为3.0%,方法重复性好。
2.7.3 中间精密度实验
按2.2.3项下供试品溶液的配制方法平行配制供试品溶液6份,同时配制对照品溶液2份,由不同的分析人员、不同时间、不同仪器、不同色谱柱,按照2.1项下的色谱条件进行测定,记录色谱图,结果中间体1供试品(MN1905242a),乙腈含量RSD为3.0%,反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量RSD为4.2%,2-氨基吡啶杂质含量RSD为3.7%;结果表明,中间体1分析方法精密度良好。
2.8.1 溶液稳定性
按2.2项下配制空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液,于室温放置0 h、2 h、4 h、16 h,按照2.1项下的色谱条件进行测定,记录色谱图,室温放置16 h,对照品溶液中乙腈峰面积RSD为0.40%,反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯峰面积RSD为3.8%,2-氨基吡啶杂质峰面积的RSD为1.2%;供试品溶液中乙腈含量RSD为0.48%,反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量RSD为3.1%,2-氨基吡啶杂质含量的RSD为2.1%;结果表明:中间体1对照品溶液、供试品溶液在室温放置16 h内稳定。
2.8.2 改变色谱条件
按2.2项下配制空白溶剂、对照品溶液、供试品溶液,分别考察不同进样口温度、检测器温度、柱升温程序,对照品溶液中乙腈峰面积RSD为0.91%,反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯峰面积RSD为3.6%,2-氨基吡啶杂质峰面积的RSD为0.84%;供试品溶液中乙腈含量RSD为1.2%,反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量RSD为3.7%,2-氨基吡啶含量的RSD为1.4%;分离度均大于1.5。
取3批样品,按照2.2.3项下的供试品溶液的配制方法平行配制2份,同时取对照品溶液2份,按照2.1项下的色谱条件进行测定,记录色谱图。结果按外标法以峰面积计算,中间体供试品MN1905241a批乙腈含量为3.88%、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量为0.36%、2-氨基吡啶含量为4.03%;供试品MN1905242a批乙腈含量为3.35%、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量为0.32%、2-氨基吡啶含量为3.98%;供试品MN1905243a批乙腈含量为3.62%、反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯含量为0.29%、2-氨基吡啶含量为4.47%;均符合限度要求。
米诺膦酸合成过程中,可能残留未反应完全的2-氨基吡啶与反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯,反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯在后续反应中,在碱性条件下,能发生水解而产生新的杂质,生成小分子有机物可溶于醇/水溶液而除去,而未除去的反式-4-氧基-2-丁烯酸乙酯由于在后边的步骤中难以去除,因此设定限度0.5%以下;2-氨基吡啶易溶于水和醇,若有剩余可通过调节pH值而有效除去,依据多批次样品检测结果和杂质清除实验结果,设定限度5.0%以下;乙腈作为回流溶剂,后续会通过烘干除去,并且在终产品中作为残留溶剂进行限度控制,因此该步骤中设定限度10.0%以下。
经验证,该方法可有效用于准确控制米诺膦酸关键中间体中杂质的含量,从而保证最终的产品质 量。