糖浓度对野生笃斯越橘组织培养苗的影响

王鑫，吴国峰，卢慧颖，张文达，张妍妍*

(1.黑龙江省林业科学研究所，哈尔滨 150081；2.黑龙江大学，哈尔滨 150006)

笃斯越橘(VacciniumuliginosumLinn.)又名野生蓝莓、笃斯等，杜鹃花科越橘属的多年生灌木或小灌木植物，耐寒、耐旱，耐瘠薄，耐病虫害，主要用于林果，具有极高的经济价值。组织培养是开展野生笃斯越橘遗传育种研究的重要技术手段，但由于驯化程度较低，开展研究较晚，对培养基的组分及配比尚未清楚，因此在组织培养过程中常出现组培苗细弱，生长不佳，分化差等问题。研究以大兴安岭笃斯越橘初选优树子代为材料，通过设置蔗糖梯度实验，对培养基中蔗糖浓度、叶片可溶性糖含量及器官分化水平三者间的互作关系展开探讨，初步确定了该选育群体最适宜的培养基蔗糖浓度。

1 材料与方法

1.1 试验材料

2019年秋季于大兴安岭采摘优良单株种子，冷冻储藏，2020年7月诱导萌发，后转入培养基，单株编号，一次标记为SS(实生)-1、2、3……n，继代培养扩繁。本试验随即选取编号SS-6、SS-35和SS-50第四代组培苗为试验材料。

1.2 试验方法

1.2.1 不同浓度糖含量对笃斯越橘组培苗继代增殖的影响。以改良MS为基本培养基，附加玉米素(ZT)0.5 mg/L，吲哚丁酸(IBA)0.5 mg/L，蔗糖浓度为20、30、40、50、60、70、80 g/L，pH值为6.8。将继代培养试管苗剪成1.5 cm左右，每茎段5片叶片，每瓶培养基接种6株，每个编号每个浓度各接种10瓶，分别标记，于(25±2)℃，24 h光照培养室培养。接种20天开始观察组培苗分化情况，60天后统计组培面分化株数，利用游标卡尺测量单株根茎直径，每个编号五个重复，求平均值。

1.2.2 不同浓度糖含量对笃斯越橘组培苗叶片可溶性糖含量的影响。利用蒽酮比色法对60天组培苗叶片进行可溶性糖测定，因为含糖60、70、80 g/L培养基中组培已经死亡，因此不对他们进行含糖量测定。利用可溶性糖系列标准溶液，在630 nm波长下测定吸光度，制定标准曲线。每个标号采取0.2 g左右新鲜叶片，测定叶片中可溶性糖含量，求得叶片糖含量。

2 结果与分析

2.1 不同浓度糖含量对笃斯越橘组培苗继代增殖的影响

2.1.1 试验结果。在试验进行20天时，接种苗分化已可见差别，从图1、2、3中可看出，含糖20、30、40、50 g/L的培养基中，接种苗分化较多，60 g/L培养基中苗分化非常少，但苗仍具活性，而70、80 g/L培养基中，苗已几乎全部死亡。

图1 SS-6在不同浓度糖含量下生长增殖情况(20 d)

图2 SS-35在不同浓度糖含量下生长增殖情况(20 d)

图3 SS-50在不同浓度糖含量下生长增殖情况(20 d)

接种60天后，对组培苗进行各项指标测定，此时由图4、5、6可看出，含糖20、30、40 g/L培养基中组培苗的分化增殖非常好，50 g/L分化较弱，苗木质化明显，而60、70、80 g/L培养基中组培苗基本死亡，具体生长及数据情况可见表1。

图4 SS-6在不同浓度糖含量下生长增殖情况(60 d)

图5 SS-35在不同浓度糖含量下生长增殖情况(60 d)

图6 SS-50在不同浓度糖含量下生长增殖情况(60 d)

表1 不同浓度糖含量对笃斯越橘组培苗继代增殖的影响

2.1.2 分析。通过上诉表格可以看出，组培苗在含糖量20～50 g/L时均分化较好，但20 g/L时苗相对较软，不利于组培苗增殖，而50 g/L时虽然分化，但是增殖倍数较少，木质化明显，都不合适下一步试验。30、40 g/L比较适合组培苗增殖，其中30 g/L分化效果较好，但是苗粗壮度不如40 g/L。

2.2 不同浓度糖含量对笃斯越橘组培苗叶片可溶性糖含量的影响

2.2.1试验结果。利用可溶性糖系列标准溶液在630 nm下吸光度制得可溶性糖标准曲线(图7)。

图7 可溶性糖标准曲线

利用标准曲线和叶片提取液测定样本在630 nm下的吸光度，计算出叶片糖含量(见表2)，并求得不同糖浓度下叶片内可溶性糖的平均值(见表3)。

表2 不同浓度糖含量对笃斯越橘组培苗叶片可溶性糖含量的影响

表3 不同糖浓度培养基中叶片平均糖含量

2.2.2 分析。在含糖量分别为20、30、40、50 g/L的培养基中，两组编号组培苗的叶片中可溶性糖含量走势基本相同，均为先升高后下降(见表2)。可溶性糖不仅是高等植物的主要光合产物，而且是碳水化合物代谢和暂时贮藏的主要形式，由此可见，在一定范围内，培养基内糖含量增高可以增加植物对糖的吸收利用，提高自身的生长光合和物质积累，但如果浓度过高，反而会起到抑制作用，甚至导致苗株死亡。

3 结论

通过培养基不同浓度糖含量对笃斯越橘组培苗分化及叶片含糖量差异的研究发现，在一定程度范围内的糖浓度对野生笃斯越橘组培苗增值都有明显的促进作用，过高或过低的蔗糖浓度会导致植株生长不健壮，叶片发黄，但浓度太高对继代分化都有抑制作用，甚至苗株死亡。有关糖类对组培苗的作用机理也有不少学者作出了解释，如孙书伟推测，低浓度蔗糖培养基可能不足以提供香花槐生根所需要的能量，因此发根晚，根生长缓慢。结合实验数据可知，在培养基加入30 g/L蔗糖对野生笃斯越橘组培苗产生的分化效果最好，而且苗株生长情况良好，适合进一步的生产研究。而如果组培苗细弱，苗株需强壮时，40 g/L蔗糖培养基则效果更佳。