广西人群 miR-365 基因 rs121224C／G 和 rs178553A／G位点多态性分布*

翁银花，陈杰，谷嬉嬉，罗艳萍，刘潮，蓝艳，韦叶生（.桂林医学院附属医院检验科，广西桂林 5400，.右江民族医学院附属医院皮肤科，广西百色 533000）

MicroRNAs（MiRNAs）是一种在物种间高度保守的内源性小非编码RNA，长度约为18 ～25 个核苷酸，其在体内主要通过与靶mRNA 3′非翻译区（3′UTR）互补位结合，在转录后水平上通过抑制mRNA翻译或促进mRNA 降解来调节基因表达。因此，也被称为内源性关键调节因子［1］。据报道，人类基因组中有已知超过2 500 种MicroRNA能特异性调节基因表达，它们参与多种细胞的过程，如细胞增殖、分化以及代谢等［2］。miR-365 作为MicroRNA家族中被研究最广泛的重要成员之一，研究表明，miR-365不仅参与众多生物的复杂调控，还被证实其异常表达与肝癌［3］、胰腺癌［4］、非小细胞肺癌［5］以及糖尿病［6］等疾病的发生、发展息息相关。近期研究表明，miR-365基因存在位点多态性，这种多态性可能对miR-365 的表达调控有一定的影响，这一发现可能成为某些肿瘤早期诊断的指标和治疗的新靶点［7］。然而，目前关于广西人群miR-365基因rs121224C／G和rs178553A／G位点遗传多态性的相关研究在国内外尚未见报道。因此，本研究采用SNPscan 技术对广西地区健康人群miR-365基因rs121224C／G和rs178553A／G基因位点进行基因分型检测，进一步分析其基因型和等位基因与不同地区人群在多态性方面存在的差异，为后期与miR-365 基因位点相关的易感性疾病的预防与治疗和群体遗传学等方面提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 随机选取2021年1月至6月于桂林医学院附属医院健康体检中心体检的健康者血液样本 294 例，男 175 例，女 119 例，年龄（54.9±8.2）岁，各项实验室指标均正常，排除自身免疫、肿瘤、心脑血管疾病以及血脂异常等疾病。各研究对象均属健康的广西独立个体，且个体间均无亲缘关系。本研究方案获得桂林医学院附属医院医学伦理委员会审核批准，所有受试者均签署知情同意书。

1.2 主要仪器与试剂 QT-1漩涡混合器 （上海琪特分析仪器公司），TD5A-WS 台式低速离心机 （长沙湘仪离心机仪器公司），DK-8D 型电热恒温水槽（上海精宏实验设备公司），FR-110 紫外分析装置、FR-250电泳仪（上海复日科技公司），多用途水平电泳槽（北京百晶生物科技公司），2720 型Thermal Cycler 扩增仪、3130型genetic analyze分析仪（美国ABI公司）。人类基因组DNA全血提取试剂盒（北京天根生化科技公司），SNPscanTM分型试剂盒、Tag DNA ligase（50 U／μL）、Tag DNA ligase Buffer（10X）购自上海天昊生物科技公司，10× PCR buffer、dNTP mix （2.5 mmol／L）、Takara HotStart Taq （5 U／μL）均购自日本 TaKaRa 公司，MgCl2（25 mmol／L，上海生工公司）、Hi-Di、GeneScanTM-500 染料（美国 ABI公司）。

1.3 方法

1.3.1 DNA 样本制备及浓度、纯度鉴定 采集各研究对象空腹静脉血3 mL，置于EDTA-K2抗凝管中，混匀后取200 μL 全血标本，按照人类基因组DNA全血提取试剂盒说明书进行DNA 样本提取，余下的样本分装于相应储存管内，置于－70 ℃储存。取1 μL DNA样本，使用紫外分光光度仪检测吸光度（A260nm／A280nm）值，取比值为 1.7 ～ 2.0，浓度为30～50 ng／μL的合格DNA样本用于后续基因分型试验。

1.3.2 引物设计与合成 通过NCBI查找miR-365基因rs121224 和rs178553 位点的碱基序列，采用Primer Premier 3.0软件对引物进行设计（表1），引物委托上海天昊公司合成。

表1 miR-365基因rs121224C／G和rs178553A／G位点的引物序列

1.3.3 PCR扩增及测序 连接反应体系总体积为20.0 μL，包括 8.0 μL DNA 样本，10.0 μL 2×连接缓冲液，0.8 μL 连接探针混合液，0.2 μL 耐热 DNA 聚合酶，1 μL 灭菌双蒸馏水补足，共20.0 μL。连接反应参数：94 ℃ 1 min，58 ℃ 4 h，循环 4 次；94 ℃2 min，72 ℃保存。连接多重 PCR 扩增体系（20.0 μL）包括 2 μL 1×GC-Ⅰ缓冲液，2.5 mmol Mg2＋，0.2 mmol dNTP，1.0 U 耐热 DNA 聚合酶，1 μL DNA样本，0.2 μL多重PCR引物，灭菌双蒸水补足至 20 μL。多重 PCR 反应参数：95 ℃ 2 min；94 ℃20 s，62 ℃ 40 s（每个循环降低 0.5 ℃），72 ℃1.5 min，循环 9 次；94 ℃ 20 s，57 ℃ 30 s，72 ℃1.5 min，循环 25 次；68 ℃ 80 min；4 ℃ 保存。将PCR 产物稀释10 倍后，取1 μL 与0.5 μL Liz500 分子量内标，8.5 μL Hi-Di 混匀，95 ℃变性 5 min，纯化后的PCR 产物上ABI3730XL 测序仪检测，收集的原始数据用 Gene-Mapper（Applied Biosystems，USA）4.1 软件进行分析。

1.4 统计分析 应用SPSS 25.0统计学软件进行。根据基因型符合Hardy-Weinberg 遗传平衡定律（P＞0.05），证明所选取样本具有群体代表性。rs121224C／G和rs178553A／G位点基因型及等位基因频率采用直接计算法计算，采用χ2检验计算不同地区人群的分布差异，以P＜0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 广西地区人群 miR-365 基因 rs121224C／G 和rs178553A／G 分 型 检 测 结 果 rs121224C／G 和rs178553A／G 位点基因型符合 Hardy-Weinberg 定律（χ2值分别为 0.097，0.082，P 值分别为 0.755 和0.774），证明所选取的样本有效。测序结果显示，rs121224C／G 位点有 3 种基因型，分别为 CC（27.9%）、GC（49.0%）和 GG（23.1%），C 和 G 等位基因频率分别为 52.4%和 47.6%。rs178553A／G 位点包含 AA（22.4%）、AG（49.0%）和 GG（28.6%）3种基因型，A 和 G 等位基因频率分别为46.9%和53.1%。基因型分型结果见图1。

图1 rs121224位点（A）及rs178553位点（B）测序结果

2.2 不同性别间 miR-365 基因 rs121224C／G 和rs178553A／G 多态性的比较 广西地区人群miR-365基因 rs121224C／G 和 rs178553A／G 位点分别以 GC（49.0%）和 AG（49.0%）基因型为多见；最高基因频率分别为 C（52.4%）和 G（53.1%）。不同性别间 rs121224C／G、rs178553A／G 位点基因型和等位基因比较，差异无统计学意义（P＞0.05），结果见表2。

表2 广西地区人群miR-365基因 rs121224、rs178553 多态性在不同性别间的比较

2.3 广西地区人群 miR-365 基因 rs121224C／G 和rs178553A／G多态性与其他地区人群比较 经统计学分析，广西地区体检健康者rs121224C／G 位点基因型、等位基因频率与 HapMap公布的CEU、YRI人群比较，差异均有统计学意义（P ＜0.05），但与HCB和JPT 地区人群比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）；rs178553A／G 位点基因型和等位基因频率与HapMap公布的CEU、JPT和YRI 地区人群比较，差异均有统计学意义（P＜0.05），而与HCB地区人群比较，差异均无统计学意义（P＞0.05）。见表3、表 4。

表3 广西地区人群miR-365 基因rs121224位点多态性与不同地区人群比较

表4 广西地区人群miR-365 基因rs178553位点多态性与不同地区人群比较

3 讨论

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNPs）是人类基因组中占比最高的变异形式（90%），主要是指在基因水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA 序列多态性，在人类基因组中平均每300 个碱基对中就有1 个 SNP，SNP 是导致miRNA失调，影响个体疾病遗传易感性的重要因素［8］。近年来，随着全基因组计划的研究不断深入，基因位点上的SNP 与疾病的易感性成为研究的热点［9-10］。有研究表明miR-SNP 与不同类型的癌症有关，包括鳞状细胞癌［11］、胃癌［12］和脑卒中［13］等。miRNA SNPs 是影响miRNA 的表达和功能的主要因素之一，Li 等［14］发现在中国汉族人群中pri-miR-218-2基因 rs11134527 位点的 A 等位基因可能是肺癌的危险因素，而 pri-miR-143 基因rs4705343位点的T等位基因可能与非小细胞肺癌风险降低相关。但同时也发现亚洲和欧洲2 个种群之间等位基因频率明显不同，这一结果提示这些SNPs如果要用作于非小细胞肺癌新的标志物，还应增加对不同背景人群中 SNPs 进行研究。miR-365作为MicroRNA的一位重要成员，在生命体中广泛存在，关于miR-365 SNPs 与疾病的相关性不少文献也有报道，Re 等［15］发现，在 miR-365b 基因rs121224中，具有CC 基因型和CG 基因型的胃癌患者胃蛋白酶原（PGⅡ）水平更高，这与胃癌患者感染幽门杆菌具有一定的相关性。Wu 等［16］发现中国北方人群miR-365b基因rs121224与饮酒亚组中的肠型胃癌风险相关，Borrmann Ⅲ～Ⅳ期肠型胃癌患者携带miR-365b 基因rs121224 位点CC 和GC基因型的预后相比 GG 基因型较差，这提示SNP 可能对不同背景胃癌患者中miR-365 的表达有一定的影响。既往研究表明同一疾病在不同区域人群中的易感性可能存在不同程度的差异，例如，脑卒中在我国东北地区的发病率较南部地区升高［17］。因此，研究遗传多态性在不同背景人群间的分布差异将为今后在基因水平上诊断和治疗某些疾病提供科学的理论依据。

本研究对 miR-365 基因 rs121224C／G 和rs178553A／G位点采用高通量SNPscan测序技术进行检测，并与千人基因组计划数据库公布的CEU、HCB、JPT 和YRI 人群的SNP 分型数据进行比较，并分析不同种族人群的差异。结果显示，广西地区人群 miR-365 基因 rs121224C／G 和 rs178553A／G位点基因型和等位基因频率在男女性别间的分布均差异无统计学意义（P＞0.05），表明两位点的多态性与性别无关。进一步与不同人群比较后发现，广西地区人群 miR-365 基因 rs121224C／G 和rs178553A／G位点的基因型和等位基因与HCB 人群相比，差异均无统计学意义。广西地区人群和HCB人群均属中国人，地理位置较近，遗传背景和物种进化来源上存在一定的同源性，故基因型分布规律的相似度也越高。rs121224C／G位点与JPT人群比较，差异无统计学意义，但rs178553A／G 位点与JPT人群比较差异具有统计学意义。造成这种结果的原因可能是广西地区人群与JPT 人群均属亚洲，距离较近，饮食文化存在诸多相似，遗传背景差异小，但同时由于广西的地理位置独特，属于多个民族聚集的地广人稀地区，气候变化和独特的喀斯特地貌以及少数民族通婚现象的普遍存在也可能是导致遗传背景差异大的原因之一。两位点基因型和等位基因与CEU 和YRI 人群比较，存在不同程度的分布差异，这有可能是因为广西地区人群CEU和YRI人群与地处不同大洲，地理位置相差甚远，且随着生活水平的提高、人口迁移、气候环境和饮食习惯以及地方风俗习惯的差异等众多因素影响，在一定程度上阻碍了基因交流［18］。分析miR-365基因的SNP 在不同地区人群的分布特点，笔者发现miR-365 基因在不同地区和人群间的突变效应存在差异性，这种差异性可能是导致同一疾病在不同背景人群中的易感性不同的原因之一，对人类群体遗传学的研究可能起非常重要的作用。

综上所述，本研究初步探讨了广西地区健康人群 miR-365 基因 rs121224C／G 和 rs178553A／G 位点的多态性分布特征，通过比较发现在不同种族人群间存在不同程度的差异，本次研究结果丰富了miR-365基因多态性在人类群体遗传学方面的研究，将为其后续相关疾病的易感性提供可参考的理论依据。然而，本研究尚存在不足，例如抽样样本量较少且样本来源单一，可能存在一定的抽样误差。因此，后续我们将加大样本量进一步验证分析miR-365基因与疾病的易感性，为群体遗传学以及相关疾病的研究提供实验依据。