屎肠球菌与酿酒酵母共发酵产γ-氨基丁酸条件优化及机制研究

孙向阳，汪 杰，姚红梅，郑淼心，李婵媛，张恕铭，张 庆

（西华大学食品与生物工程学院，四川成都 610039）

γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是一种四碳氨基酸，广泛存在于生物体内，由L-谷氨酸经谷氨酸脱羧酶（glutamate decarboxylase，GAD）脱羧合成[1]，具有降压[2]、抗抑郁[3]、预防糖尿病[4]、缓解疼痛[5]等功能。随着年龄增长，人体内的GABA 合成能力不断减弱，会出现失眠、焦躁、疲乏等症状，因此日常进食含GABA 的食药品是补充该功能物质的一种有效方式[6]。然而，动植物体内的GABA 含量低，难以大量提取分离，寻求高效合成GABA 的途径受到越来越多研究者的关注[7]。微生物发酵合成GABA不受时间、空间、能源的限制，且兼有低成本、高产量等显著特点，成为当前生产食药级GABA 较为理想的途径[8]。目前微生物产GABA 的研究大多使用单一乳酸菌发酵[9−12]，而以乳酸菌和酵母菌共发酵产GABA 的研究鲜有报道。

对于底物成分复杂的发酵体系，单一纯种发酵具有明显的应用局限，优势互补的多菌株协同发酵为解决该局限性提供了新的思路[13]。特别是乳酸菌酵母菌之间的良性互动，为解决单一纯种发酵某些底物难以代谢的问题营造了良好的代谢环境。有研究表明，共生乳酸菌酵母菌的互作可基于营养物质交换，从而促进菌株的生长代谢以提高目标化合物的产量[14]；乳酸菌难以代谢蛋白质，引入蛋白质代谢能力较强的酵母菌产生的各种氨基酸则可以被乳酸菌良好利用，且酵母菌也可产生维生素和肽类等营养因子[15]；乳酸菌也可利用酵母菌难以代谢的苹果酸等物质，产生丙酸、丁酸，作为酵母菌合成风味物质的前体[16]。基于以上研究，筛选具有共生作用的乳酸菌和酵母菌并采用共发酵的方式提高GABA 产量是可行的。

屎肠球菌为常见的肠道益生乳酸菌，可改善哺乳动物体内的肠道环境，增强免疫能力，对哺乳动物的生长及肠道菌群的稳定具有重要的意义[17]。酿酒酵母为具有潜在益生特性的菌株，广泛应用于食品、医药及饲料等行业[18]。通过合理构建屎肠球菌和酿酒酵母的共发酵条件从而提高GABA 产量，以及研究其高产GABA 机理具有重要的意义。因此，本研究以前期筛选的产GABA 的屎肠球菌AB157 和酿酒酵母SC-125 为发酵菌株，研究采用共发酵提高GABA 产量，通过响应面分析法优化共发酵的发酵条件，且分析GAD 酶活及互作模式，旨在为具有共生作用的乳酸菌和酵母菌高产GABA 及机理探讨提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

本实验室筛选鉴定的产GABA 的屎肠球菌AB157[19]（Enterococcus faeciumAB157，NCBI 登录号MH578625）和酿酒酵母SC-125（Saccharomyces cerevisiaeSC-125，NCBI 登录号为MW279237） 西华大学古法发酵（酿造）生物技术研究所保藏；GABA

色谱纯（含量≥98%），上海金穗生物科技有限公司；丹磺酰氯 色谱纯（含量≥98%），成都华夏化学试剂有限公司；L-谷氨酸钠（L-monosodium glutamate，L-MSG） 分析纯（含量≥98.5%），成都科龙化工试剂厂；MRS 肉汤、MRS 选择性琼脂、YPD 液体培养基和PDA 选择性琼脂参照文献[20]配制，根据需要添加不同质量浓度的L-MSG。

FA1104 电子天平 上海舜宇恒平有限公司；pHS-3C pH计成都方舟科技公司；Allerga X-15R 冷冻离心机 美国赛默飞公司；JY98-IIIDN 超声细胞破碎机 宁波新芝生物科技有限公司；GM-0.33AL 隔膜真空泵 天津津腾实验设备有限公司；Waters2695高效液相色谱 美国Waters 公司。

1.2 实验方法

1.2.1 共发酵的单因素实验 选择培养至对数生长期的屎肠球菌AB157（8.79 lg （CFU/mL））和酿酒酵母SC-125（7.81 lg （CFU/mL））作为种子。根据查阅文献及前期试验筛选[21−22]，以MRS 肉汤为基础培养基。在总接种量为2%（V/V），分别考察在接种比例为1:1（V/V），L-谷氨酸钠添加量为12 g/L，静置发酵96 h 时，不同发酵温度（30、32、35、38、40 ℃）；在发酵温度为35 ℃，L-谷氨酸钠添加量为12 g/L，静置发酵96 h 时，不同屎肠球菌AB157 和酿酒酵母SC-125 接种比例（1:4、1:2、1:1、2:1、4:1、6:1、1:0、0:1（V/V））；在发酵温度为35 ℃，接种比例为4:1（V/V），静置发酵96 h 时，不同L-谷氨酸钠质量浓度（0、4、8、12、16、20 g/L）；及在发酵温度为35 ℃，接种比例为4:1（V/V）和L-谷氨酸钠添加量为12 g/L 时，不同发酵时间（0、12、24、36、48、60、72、84、96、108、120 h）对屎肠球菌AB157 和酿酒酵母SC-125 共发酵时GABA 产量和活菌数的影响。

1.2.2 响应面试验 在单因素实验的基础上，以发酵温度、接种比例和L-谷氨酸钠质量浓度为考察因素，选取相应的响应面设计中心点，以GABA 产量为响应值，对试验数据进行优化试验。因素水平见表1。

1.2.3 GABA 含量测定 GABA 参照Zhang 等[23]利用丹磺酰氯衍生的方法，采用HPLC 分析。HPLC检测条件：色谱柱为ODS-C18柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；检测波长254 nm；柱温30 ℃；进样10 μL；水系为四氢呋喃-甲醇-乙酸钠溶液（4.1 g/L，乙酸调pH 至6.2）=1:15:84（V/V/V），有机系为甲醇；1 mL/min梯度洗脱，水系比例为：80%保持6 min，14 min 降至50%，1 min 降至0%，0%保持5 min，1 min 升至80%，80%保持3 min，总洗脱时间30 min。

1.2.4 选择性培养基法测定活菌数 待测菌液适当稀释，涂布计数。其中共发酵同时用MRS 选择性琼脂和PDA 选择性琼脂计数，屎肠球菌单菌发酵用MRS 选择性琼脂计数，酿酒酵母单菌发酵用PDA选择性琼脂计数。

1.2.5 GAD 酶活力测定

1.2.5.1 GAD 粗酶液制备 参照彭春龙等[24]的试验方法，略有修改，收集最优条件下不同发酵时期及不同发酵体系的菌体，10000 r/min，4 ℃离心10 min，PBS 洗涤2 次，保留菌体；加入等体积含2.47 mg/mL磷酸吡哆醛，0.2 mg/mL 溶菌酶的0.02 mol/L 磷酸钠缓冲液（pH7.2）悬浮菌体，37 ℃振荡1 h，冰浴细胞破碎，功率400 W，运行时间5 s，间歇时间5 s，循环180 次。破碎液4 ℃、10000 r/min 离心10 min，去除沉淀，即为GAD 粗酶液。

1.2.5.2 GAD 酶活力测定 取GAD 粗酶液400 μL，与等体积底物溶液（0.02 mol/L 磷酸钠缓冲液，pH4.4，含12 g/L L-MSG，2.47 mg/mL 磷酸吡哆醛）混合，37 ℃温浴30 min，置于沸水浴中10 min，离心收集上清液，采用HPLC 测定生成的GABA，HPLC 条件同1.2.3。酶活（U）定义：在试验条件下，1000 μL 粗酶液1 min 产生1 μmol GABA 的酶量。

1.2.6 无细胞上清液对菌株发酵产GABA 的影响收集培养至12 h 的屎肠球菌AB157 单菌发酵液、酿酒酵母SC-125 单菌发酵液及屎肠球菌AB157 和酿酒酵母SC-125 共发酵液，调pH 与MRS 肉汤pH 相等，将发酵液在8000 r/min 转速下离心10 min，取上清液，过0.22 μm 有机滤膜，收集上清液即为无细胞上清液（cell-free supernatant，CFS）。

将制备的屎肠球菌AB157 CFS、酿酒酵母SC-125 CFS 和共发酵CFS 分别按培养基总体积分数20%的量加入到MRS 肉汤（L-MSG 终浓度为12 g/L）中，等体积的MRS 肉汤作对照[14]。分别接入酿酒酵母SC-125（2%，V/V）和屎肠球菌AB157（2%，V/V）进行单一菌株发酵，35 ℃发酵96 h，测定GABA 产量。

1.3 数据处理

试验数据采用SPSS 20.0 进行显著性分析，柱状图折线图采用Origin 8.5 进行绘制，响应面采用Design Expert 8.0.6 分析。每组试验三个平行，所有结果用平均值±标准差表示。

2 结果与分析

2.1 共发酵单因素实验

2.1.1 发酵温度对共发酵产GABA 和活菌数的影响

发酵温度对GABA 产量（图1A）和活菌数（图1B）影响结果如图1 所示。随温度升高，共发酵及屎肠球菌AB157 单菌发酵中的GABA 浓度表现为先显著增加后逐渐降低，在35 ℃达到GABA 产量最大值，GABA 最高产量为共发酵4.81 g/L，屎肠球菌AB157单菌发酵为3.66 g/L，酿酒酵母SC-125 单菌发酵为0.14 g/L。分析发酵体系的活菌数（图1B）可知，屎肠球菌AB157 在共发酵和单菌发酵中，其活菌数随温度的改变变化不大，当发酵温度高于35 ℃时，其活菌数开始下降；酿酒酵母SC-125 的活菌数随着发酵温度的升高逐渐降低，温度升高其生长被显著抑制。发酵温度可影响微生物的代谢以及胞内催化L-MSG生成GABA 的酶GAD 的酶活力，适宜的发酵温度有助于提高GABA 的产量[25−26]。因此，确定共发酵的温度为35 ℃。

图1 发酵温度对GABA 产量及活菌数的影响Fig.1 Effect of fermentation temperature on GABA yield and viable cell counts

2.1.2 接种比例对共发酵产GABA 和活菌数的影响不同接种比例对GABA 产量（图2A）和活菌数（图2B）影响结果如图2 所示。由图2A 可知，当屎肠球菌AB157 和酿酒酵母SC-125 的接种比例为4:1 时，GABA 产量最高，达6.44 g/L。由图2B 可知，不同接种比例对屎肠球菌AB157 的活菌数影响不大；而随着接种比例的增加，酿酒酵母SC-125 的活菌数呈下降趋势。有研究表明，酿酒酵母可分泌营养因子促进乳酸菌的代谢，且消耗氧气和产生CO2为乳酸菌提供良好的生长环境[27−29]。适宜的接种比例可为共发酵体系中微生物的生长及GABA 的转化合成提供良好的环境。因此，确定最适接种比例为4:1。

图2 接种比例对GABA 产量和活菌数的影响Fig.2 Effect of inoculum proportions on GABA yield and viable cell counts

2.1.3 底物浓度对共发酵产GABA 和活菌数的影响不同L-谷氨酸钠质量浓度对GABA 产量（图3A）和活菌数（图3B）影响结果如图3 所示。由图3A 可知，各发酵体系中的GABA 产量随着L-谷氨酸钠浓度的增加表现为先显著增加后逐渐降低，添加L-谷氨酸钠12 g/L 时，共发酵GABA 产量达到最大6.56 g/L，此时屎肠球菌和酿酒酵母单菌发酵GABA产量分别为3.67 g/L 和0.13 g/L。由图3B 可知，不同L-谷氨酸钠浓度对屎肠球菌AB157 的活菌数基本无影响，而在共发酵体系中，随着底物浓度增加，酿酒酵母SC-125 的活菌数呈现先增加后降低的趋势。Komatsuzaki 等[30]研究表明，适量的增加L-谷氨酸钠有利于微生物的生长和产物GABA 的生成，但L-谷氨酸钠浓度过高，发酵体系的渗透压增大，微生物的代谢会受到抑制，GABA 的产量反而降低。因此，确定最适的L-谷氨酸钠质量浓度为12 g/L。

图3 底物浓度对GABA 产量及活菌数的影响Fig.3 Effect of substrate concentration on GABA yield and viable cell counts

2.1.4 发酵时间对共发酵产GABA 和活菌数的影响不同发酵时间对GABA 产量（图4A）和活菌数（图4B）影响结果如图4 所示。由图4A 可知，各发酵体系中的GABA 产量随着发酵时间的延长而显著增加，在96 h 时，共发酵GABA 产量达到最大6.57g/L，且高于单菌发酵，随后趋于稳定。由图4B可知，屎肠球菌AB157 和酿酒酵母SC-125 的活菌数随着发酵的进行其变化趋势基本一致，且在达到对数生长期后趋于稳定。因此，确定最适宜的发酵时间为96 h。

图4 发酵时间对GABA 产量及活菌数的影响Fig.4 Effect of fermentation time on GABA yield and viable cell counts

2.2 响应面试验优化结果

采用Box-Behnken 响应面设计结合单因素试验结果，以发酵温度（A）、接种比例（B）和L-谷氨酸钠质量浓度（C）为自变量，GABA 产量为响应值。以发酵温度35 ℃、接种比例4:1 和底物浓度12 g/L 为分析中心点（如表2），进行响应面试验。

表2 响应面试验设计与结果Table 2 Response surface experimental design and results

对试验数据进行拟合分析，得到以GABA 产量（Y）的回归方程：

根据回归模型方差分析（表3）可知，该模型极显著，即P<0.0001，F=178.69，且失拟项P>0.05 不显著，表明该模型可用于发酵预测。此外，R2=0.9957，可以解释99.57%的响应值变化，校正后R2Adj=0.9901与R2接近，表明模型拟合度较好。以上结果表明该模型拟合度较好，可用于试验预测。同时，发酵温度（A）、接种比例（B）、L-谷氨酸钠质量浓度（C）和A2、B2及C2的P值小于0.01，表明对GABA 的产量影响极显著；交互项中，AC 达到极显著水平（P<0.01），表明发酵温度和L-谷氨酸钠质量浓度的交互作用对GABA 的生成影响最为显著。由F值可知，影响GABA 产量的因素依次为L-谷氨酸钠质量浓度>接种比例>发酵温度。

表3 回归模型方差分析Table 3 Analysis of variance of regression model

对该回归方程分析，得到最优的共发酵条件为发酵温度35.26 ℃、屎肠球菌AB157 和酿酒酵母SC-125 的接种比例4.92:1（V/V）、底物浓度12.24 g/L，该条件下预测GABA 产量为6.67 g/L。

为验证预测的可靠性，结合最优值和实际应用确定共发酵因素值为：发酵温度35 ℃、接种比例为5:1（V/V）、底物浓度12 g/L。重复试验三次，试验结果为，优化条件下GABA 产量为6.55±0.09 g/L，与预测接近，且GABA 产量与屎肠球菌单菌发酵（3.67 g/L）相比，提高到1.78 倍。

2.3 GAD 酶活力分析结果

在最优条件下，分析不同时间以及不同发酵体系中微生物GAD 酶活力（图5A）与GABA 产量（图5B）的关联。GAD 为催化L-MSG 生成GABA 的限速酶[31]，因此GAD 酶活力的检测对于研究GABA的合成能力尤为重要。由图5A 可知，GAD 酶活随时间变化表现为先显著增加后逐渐降低的趋势，在12 h 时共发酵体系酶活达到最高，为1.14 U，此时屎肠球菌和酿酒酵母单菌发酵分别为0.84 U 和0.01 U，且发酵12 h 后，共发酵体系GAD 酶活显著高于单菌发酵体系。由图5B 可知，共发酵中GABA 产量显著高于单菌发酵。以上结果表明，共发酵中GABA产量的显著提高与GAD 酶活的显著增强紧密相关。

图5 谷氨酸脱羧酶（GAD）酶活力与GABA 产量测定结果Fig.5 The result of glutamate decarboxylase （GAD） activity and GABA yield

2.4 添加CFS 对GABA 产量的影响

有研究表明乳酸菌和酵母菌在发酵环境中能够通过生物膜包被、群体感应或营养代谢产物交换等方式进行相互作用，从而影响发酵进程[32−33]。本研究通过分别添加CFS 探究是否存在营养代谢产物交换的相互作用影响菌株产GABA，结果见图6。结果表明，添加屎肠球菌AB157 CFS 和共发酵CFS 后，酿酒酵母SC-125 发酵产GABA 分别为0.18 g/L 和0.17 g/L，高于对照组的0.13 g/L；添加酿酒酵母SC-125 的CFS 后，屎肠球菌AB157 发酵产GABA 为4.61 g/L，高于对照组的3.77 g/L，但添加共发酵的CFS 后，对其产GABA 无显著影响，具体原因有待进一步研究。上述表明，屎肠球菌AB157 或酿酒酵母SC-125 的CFS 对GABA 产量提升有帮助，其具体作用机制接下来将进一步深入研究。

图6 添加CFS 对GABA 产量的影响Fig.6 Effect of adding CFS on GABA yield

3 结论

本试验研究产GABA 屎肠球菌AB157 和酿酒酵母SC-125 采用共发酵提高GABA 产量，及分析相互作用和关键酶GAD。采用单因素和响应面分析法优化共发酵条件，确定在总接种量为2%（V/V）的共发酵条件为发酵温度35 ℃、屎肠球菌AB157和酿酒酵母SC-125 的接种比例5:1（V/V）、底物浓度12 g/L，发酵时间96 h，此时，GABA 产量为6.55 g/L，与屎肠球菌单菌发酵相比，产量提高到1.78倍；高产GABA 机制研究表明，共发酵体系的高GAD酶活及菌株发酵代谢物的营养供给对GABA 的产量提高有明显促进作用。接下来，基于屎肠球菌AB157和酿酒酵母SC-125 共培养高产GABA 的相互作用，对其具体互作机制将进行深入研究。