柳枝药材质量标准提升研究

祝清灿，张双情，孙宜春，汪 娥，石 亚，王 杏，段 丽，李慧馨

(国药集团同济堂(贵州)制药有限公司，贵州 贵阳 550026)

柳枝为杨柳科植物垂柳SalixbabylonicaL.的新鲜或干燥枝条，气微，味微苦、涩，四季采收，去叶，鲜用或切段，晒干，为《贵州省中药材、民族药材质量标准》收录的贵州省少数民族用药，广泛分布于长江流域及华南各地，贵州各地普遍栽培，具有祛风利湿、解毒消肿的功效，用于风湿痹痛、小便淋浊、黄疸、龋齿、龈肿、风疹瘙痒、疔疮、丹毒等[1-2]。据文献报道，柳属植物普遍含有黄酮类化合物，以及萜类、醌类、酚苷类、苯丙素类及蒽醌类等化学成分，其中水杨苷及其多种衍生物是柳属植物中最为广泛存在的物质，分布在柳属植物的树皮、根皮、叶片中[3-4]。水杨苷是柳属植物，具有解热镇痛功效的主要活性物质是其主要的功效成分，可用于退热和治疗关节炎等疾病[5-6]。原标准项下仅收载性状、显微鉴别、理化鉴别项目[1]，显微鉴别时一般是对药材进行制片显微观察，但在实际制片过程中切片厚薄不均匀、易碎，制片较困难。理化鉴别方法专属性不强，影响结果的准确性。因此对原标准进行修订，将横切面显微鉴别改为粉末显微鉴别，将理化鉴别改为薄层色谱鉴别，提高方法的可操作性和专属性，同时，增加水分、总灰分、浸出物检查，为质量标准修订提供参考。

1 仪器与材料

1.1 仪器

WHF-3型三用紫外分析仪(武汉药科新技术开发有限公司生产)；CX41型显微镜(OLYMPUS CORPORATION)；101-2A型电热鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)；HH-4型数显恒温水浴锅[ 常州普天仪器制造有限公司(金坛市晶玻实验仪器厂)]，ME204TE/02型电子天平[梅特勒-托利多国际贸易(上海)有限公司]；SB25-12DTS型数控超声波清洗器(宁波新芝生物科技股份有限公司)。

1.2 试药

水杨苷对照品(购自北京百灵威科技有限公司，批号：195686，含量98%)；丙酮(批号：20161001)、正丁醇(批号：20170301)、甲醇(批号：20161001)、乙醇95%(批号：20170901)、甲酸(批号：20091009)、硫酸(批号：20160801)、三氯甲烷(批号：20170801)购自重庆川东化工(集团)有限公司；石油醚(30～60 ℃)(批号：20160801)、乙酸乙酯(批号：2016071501)购自成都科隆化学品有限公司。

1.3 材料

羧甲基纤维素钠(厂家：天津市致远化学试剂有限公司，批号：2016041022)；薄层层析硅胶G(批号：20151008)、硅胶G薄层板(批号：20170929)、硅胶G高效板(批号：20170831)、硅胶H板(批号：20160715)、硅胶GF254板(批号：20140910)均购自青岛海洋化工有限公司；硅胶G预制板(德国默克公司，批号：1.05626.0001；国药集团化学试剂有限公司，批号：20170912)；自制硅胶G薄层板(批号：20171120)。

样品由国药集团同济堂(贵州)制药有限公司种植部提供，经贵州中医药大学药学院何顺志教授鉴定为杨柳科植物垂柳SalixbabylonicaL.的新鲜或干燥枝条。凭证标本存放于国药集团同济堂(贵州)制药有限公司。样品详细信息，见表1。

表1 样品名称及产地来源

2 方法与结果

2.1 性状鉴别

将采集的药材样品除去杂质后晒干，对药材样品的大小、形状、颜色、质地、断面等特征进行对比观察，对具有代表性的药材进行拍照。其基本特征为：鲜柳枝：枝条圆柱形，直径0.1～5 cm，段长不少于10 cm，表面暗绿色或黄棕色，无毛，上有明显的圆点状小枝痕，幼枝微有毛；气微，味微苦、涩。干柳枝：外表黄褐色或棕黄色，表面微有纵皱纹。见图1。

图1 柳枝外观

2.2 显微鉴别

将样品粉碎并进行肉眼观察和显微观察，其特征为：本品粉末灰褐色；晶纤维易见，方晶众多；草酸钙簇晶多见，直径11～28 μm，具缘纹孔导管；木栓细胞类方形、类三角形，内含黄棕色物。柳枝粉末显微特征，见图2。

注：1.草酸钙簇晶；2.晶纤维；3.具缘纹孔导管；4.木栓细胞。

2.3 薄层鉴别

2.3.1 供试品溶液制备 取本品粉末5 g，加乙醇 50 mL，加热回流30 min，加入25 mL 氢氧化钙乳浊液(1 g 氧化钙加10 mL水溶解)混匀，滤过，滤液挥干，残渣加水20 mL使溶解，加石油醚(30～60 ℃)20 mL萃取1次，弃去石油醚萃取液，母液置水浴上挥干，残渣加甲醇2 mL使溶解，作为供试品溶液[7-9]。

2.3.2 对照品溶液制备 取水杨苷对照品适量，加甲醇制成每1 mL含5 mg的溶液，作为对照品溶液。

2.3.3 薄层鉴别方法及结果 照薄层色谱法(《中国药典》2020年版四部通则0502)进行试验[10]，吸取上述对照品溶液4 μL，供试品溶液2～5 μL，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(7∶3∶1∶1)为展开剂，预饱和20 min，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃下加热至斑点显色清晰。置日光下检视，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点。见图3。

注：1～4、6～9为供试品；5.水杨苷对照品。

2.4 水分含量测定

精密称取10批柳枝药材粉末(过二号筛)各约4 g，按照2020年版《中国药典》(四部)通则“0832水分测定法”的第二法(烘干法)进行测定[10]，每批样品平行测定两份，取平均值。结果，12批样品中水分的含量最低为8.8%，最高为12.3%，平均值为10.6%，以平均测定值的120%设限，结果为12.72%，故建议将水分标准定为不得过13.0%。柳枝药材水分含量测定结果，见表2。

2.5 浸出物含量测定

精密称取10批柳枝药材粉末(过二号筛)各约3 g，照醇溶性浸出物测定法(《中国药典》2020版四部通则2201)项下热浸法测定[10]，用50%乙醇作溶剂，每批样品平行测定两份，取平均值。结果，12批样品中浸出物最低值为7.9%，最高值为10.2%，平均值为9.01%，以平均值的80%设限，结果为7.2%，故建议将浸出标准定为不得少于7.0%。柳枝药材浸出物含量测定结果，见表2。

表2 柳枝水分和浸出物测定结果 (%)

3 讨论

3.1 供试品溶液制备

根据化学成分的溶解性，分别对提取溶剂(甲醇，乙醇，水)、提取方法(超声，回流)、萃取溶剂(乙酸乙酯，石油醚)、提取溶剂用量(30 mL，40 mL，50 mL)、提取时间(30 min，60 min，90 min)、萃取剂用量(10 mL，20 mL，30 mL)等条件进行考察，结果表明，以本研究所用制备方法制备的供试品溶液鉴别斑点最清晰。

3.2 色谱条件考察

根据展开样品主要化学成分的极性，对展开系统，如乙酸乙酯-丙酮-甲酸-水(7∶3∶1∶1)、氯仿-乙酸乙酯-甲醇-甲酸(8∶1∶3∶0.1)、 氯仿-甲醇(7∶3)、氯仿-乙酸乙酯-甲醇-水(5∶2∶2∶0.2)、乙酸乙酯-甲醇-水(9∶2∶0.2)、乙酸乙酯-甲醇-水(11∶2∶1)、硅胶板种类(硅胶G板、硅胶H板，硅胶GF254板，硅胶G高效板)、点样量(2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，10 μL)、条带点样宽度(5 mm，6 mm，7 mm，8 mm)、薄层板预平衡时间(10 min，20 min，30 min)、展开温度(5 ℃，20 ℃，35 ℃)等进行了考察。结果表明，采用本研究所用色谱条件时，展开效果较好，斑点清晰，伪品无相应斑点。见图4。

注：1、4、6为水杨苷对照品；2.鲜柳枝供试品；3.干柳枝供试品；5.伪品。

3.3 浸出物测定方法考察

在进行浸出物测定时，对浸出方法(冷浸法，热浸法)、浸出溶剂种类(甲醇，乙醇，水)、浸出溶剂(乙醇)浓度(25%，50%，75%，95%)进行考察，结果，使用本研究所用浸出方法和溶剂测定时，浸出物含量最高。

4 结语

综上，柳枝的显微鉴别特征易见，可操作性强；薄层色谱鉴别方法专属性强，薄层色谱斑点清晰，分离度较好，伪品为阴性；增加水分、灰分检查后，质量标准更完善。本研究可为提高柳枝药材的质量控制标准提供科学依据。