金花茶叶提取物体内祛痰、抗炎作用及其机制研究

曾英港，陈辉华，钟益宁，2*，李丽娟，李 玲，蔡秀琳

(1.广西中医药大学，广西 南宁530200；2.玉林师范学院，广西 玉林537000)

金花茶(Camelliachrysantha(Hu) Tuyama)为山茶科山茶属，是一种小型常绿乔木，高2～5 m[1]。金花茶物种较多集中在广西，我国云南、肇庆、四川、贵州等地也有分布和栽培，其中，广西防城港还将金花茶定为“市花”。其叶和花均是传统壮药，《广西壮族自治区壮药质量标准》[2]对其有收录记载，金花茶可以药食两用，被开发成许多高附加值产品应用到保健养生、美容护肤、食品添加等多个方面。

目前金花茶叶的研究方向主要涵盖药材鉴定、药材栽培、化学成分鉴定、含量成分测定、药理活性研究等方面，而药理作用研究主要集中在抗肿瘤、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、抗菌和抗过敏等方面[3-4]。因地域局限，国外对其研究较少。据《中华本草》[5]《现代本草纲目》[6]记载，金花茶叶具有清热解毒、止痢的功效，治疗咽喉炎、高血压、便血、月经不调等也有一定效果。本研究探讨金花茶叶醇提取物的祛痰和抗炎活性作用及其可能机制，以期为今后金花茶的开发利用提供实验基础，为研发防治或改善呼吸系统炎症的创新药物提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物 SPF级昆明种小鼠，雌雄各半，体质量18～22 g，由湖南斯莱克景达实验动物有限公司提供，许可证号：SCXK(湘)2016-0002。

1.1.2 药品与试剂 金花茶叶(防城港市防城港区农场)经广西中医药大学药用植物教研室滕建北教授鉴定为山茶科山茶属金花茶(Camelliachrysantha(Hu) Tuyama)的干燥叶；醋酸地塞米松片(浙江仙琚制药股份有限公司，批号：170768)；急支糖浆(太极集团重庆涪陵制药厂有限公司，批号：18100110)；生理盐水(广西裕源药业有限公司，批号：R18050804)；苯酚红(天津市大茂化学试剂厂，批号：20180927)；二甲苯(西陇科学股份有限公司，批号：1902222)；角叉菜胶(上海伊卡生物技术有限公司，批号：9000-07-1)；酶联免疫分析试剂盒(武汉基因美科技有限公司，批号：JYM0531Mo、JYM0554Mo、JYM0218Mo、JYM0012Mo)；95%乙醇(成都市科隆化学品有限公司，批号：2017112301)；甲苯(西陇科学股份有限公司，批号：1902222)；浓氨水(成都市新都区木兰镇工业开发区，批号：2015012001)。

1.1.3 仪器 HH-S4电热恒温水浴锅(金坛市医疗仪器厂)；旋转蒸发仪(德国海道尔夫公司)；电子天平(瑞安市英衡电器有限公司)；SQP分析天平(赛多利斯科学仪器(北京)有限公司)；TGL-16G离心机(上海安亭科学仪器厂)；UV-1780紫外分光光度计(岛津仪器(苏州)有限公司)；WH-2000超声波雾化器(广东粤华医疗器械厂)；酶标仪(Tecan公司)；恒温恒湿培养箱(韶关市科力实验仪器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 金花茶叶醇提取物的制备 选取适量金花茶叶，分别用70%、60%、50%乙醇溶液80 ℃依次水浴回流提取3次，每次1 h，合并过滤、浓缩，将浓缩液定容，得到醇提取物储备液。使用时，稀释得到浓度分别为20 mg/mL、60 mg/mL、100 mg/mL的金花茶叶醇提取物溶液。

1.2.2 阳性组溶液的制备 取地塞米松片12片(0.75 mg/片)研磨成细粉，用生理盐水溶解，得到浓度为0.2 mg/mL的地塞米松溶液。

1.2.3 祛痰实验 ①酚红标准曲线的制备：精密称取酚红5.000 mg，加入氢氧化钠溶液溶解，转移至容量瓶用5%碳酸氢钠溶液进行稀释，定容，制得50 μg/mL酚红标准溶液。用移液管分别精密吸取酚红标准溶液1.0 mL、2.0 mL、3.0 mL、4.0 mL、5.0 mL至50 mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，充分摇匀，选取其中1个样品，以紫外分光光度计对其进行扫描，记录λmax，并在λmax处测定5个样品的吸光度。以吸光度为纵坐标，酚红浓度(μg/mL)为横坐标，绘制酚红的标准曲线。②酚红排泌实验：取SPF级昆明种小鼠，每只体质量18～22 g，雌雄各半，随机分为5组，每组 12只，即空白组、阳性组(急支糖浆组)、金花茶叶醇提物的低、中、高剂量组。连续灌胃给药7 d，采用酚红排泌法[7]，末次给药0.5 h后，对小鼠腹腔内注射5%酚红溶液2 mL，0.5 h后，剥离气管周围组织，剪下自甲状软骨下至气管分支处的一段气管，加入0.9%生理盐水2 mL、1 mol/L NaOH 0.1 mL浸泡1 h，再超声10 min，离心3 min，3 000 r/min，取上层清液于559 nm测定其吸光度值，计算出小鼠气管中酚红的含量。

1.2.4 抗炎实验 ①耳肿胀实验：参考文献[8]，取SPF级昆明小鼠，雌雄各半，适应性饲养5天，随机分为5组，每组12只，即提取物低、中、高剂量组(0.5 g/kg、1.5 g/kg、2.5 g/kg)，阳性组(地塞米松组5 mg/kg)，空白组。除空白组给予蒸馏水，其他组给予相应药物。连续灌胃给药7 d，末次给药0.5 h后，用二甲苯涂抹小鼠右耳，40 μL/只，1 h后将每组小鼠脊椎脱臼处死，用8 mm耳片打孔器在同一部位处打出小鼠的左、右耳片，精密称重小鼠耳片重量，算出抑制率。计算公式：耳肿胀度=右耳片的重量-左耳片的重量；抑制率=(空白组肿胀度均值-给药组肿胀度均值)/空白组肿胀度均值×100%。②足肿胀实验：小鼠分组、给药方法同“耳肿胀实验”，参考文献[8]。末次给药1 h后，在小鼠右足趾同一部位(右后足朝向踝关节方向)皮下注射0.1 mL 的1.0% 角叉菜胶溶液，用于制造炎症模型，并于致炎后再灌胃给予相应药物1次，观察小鼠足趾肿胀程度，4 h后将每组小鼠脊椎脱臼处死，用剪刀沿踝关节剪下两足，并精密称量各组小鼠足趾质量，计算抑制率。计算公式：足肿胀度=右足质量-左足质量；抑制率=(空白组肿胀度均值-给药组肿胀度均值)/空白组肿胀度均值×100%。

1.2.5 酶联免疫吸附(ELISA)实验 参考文献[9]，分组给药方式与“1.2.4”项下相同，每天灌胃给药2次，连续14 d，末次给药1 h后，除了空白组，精密吸取300 μL二甲苯溶液涂抹在其余组小鼠右侧的腹部和背部，同时将0.4% 醋酸溶液进行腹腔注射，0.2 mL/只，用于制造炎症模型。在致炎3 h后眼球取血，将血液全部收集在2.5 mL的离心管中。将血液样品进行离心20 min，3 000 r/min，取上清按ELISA试剂盒说明书的操作步骤，对血清中的TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-17A进行含量测定，若样品出现沉淀，需要离心后再进行测定。

2 结果

2.1 金花茶叶醇提取物对小鼠的祛痰作用

得到的酚红标准曲线：y=0.183 2x+0.016 11，R2=0.999 8，其中y为吸光度值，x为酚红溶液的浓度(μg/mL)。与空白组比较，金花茶叶醇提取物各剂量组小鼠气管酚红的排泌量显著增加，差异有统计学意义(P<0.01)，且急支糖浆组酚红的排泌量少于高剂量组。结果见表1。

表1 金花茶叶醇提取物祛痰作用结果

2.2 金花茶叶醇提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀作用

涂抹二甲苯溶液后，观察各组小鼠的形态，发现每组小鼠耳朵都有不同程度的肿胀，且部分小鼠的耳朵血管变红，清晰可见。与空白组比较，地塞米松组、提取物各剂量组均能够显著抑制二甲苯引起的耳肿胀(P<0.01)。随着金花茶叶醇提取物的剂量增大，抑制效果逐渐增强，且中、高剂量组优于地塞米松组。具体结果见表2。

表2 金花茶叶醇提取物对二甲苯致小鼠耳肿胀作用结果

2.3 金花茶叶醇提取物对角叉菜胶致小鼠足肿胀作用的影响

皮下注射角叉菜胶后，发现每组小鼠足部都有不同程度的水肿，随着时间推移，小鼠足部越来越肿，在第4 h时，小鼠的足肿胀程度最为明显，5 h后足肿胀度逐渐变小。与空白组比较，地塞米松组、低、中、高剂量组均能够抑制小鼠足肿胀(P<0.05或P<0.01)，且高剂量组的抑制作用和地塞米松组相当。具体结果见表3。

表3 金花茶叶醇提取物对角叉菜胶致小鼠足肿胀作用结果

2.4 金花茶叶醇提物对致炎小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-17A含量的影响

空白组与模型组比较(表4)，小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-17A的含量水平显著增加(P<0.01)，说明通过使用二甲苯溶液和醋酸溶液造模后，小鼠血清中的炎症细胞因子含量增高，致炎成功。提取物各剂量组和模型组比较，低、中、高剂量组能够显著抑制TNF-α的含量(P<0.01)，同时，中、高剂量组能显著减少IL-17A、IL-1β的含量，高剂量组能够有效减少IL-6的含量。

表4 小鼠血清TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-17A含量结果

3 讨论

酚红排泄法是药理实验中一种用于筛选祛痰药物的可靠实验方法。痰液作为由肺泡、气管和支气管分泌出来的黏液，是引起咳嗽的一个重要因素。当其分泌量增多时，可减少对呼吸道黏膜的刺激，从而起到止咳作用。二甲苯致耳肿胀以及角叉菜胶致足肿胀都属于急性炎症模型，能够复制化学因子引起的炎症模型，常用于筛选和评价药物的抗炎作用。与炎症相关细胞因子可分为两类：一是促炎因子，包括 IL-1α、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-17、IL-18、INF-γ、TNF-α等，二是抗炎因子，主要有IL-4、IL-10等[12]。炎症是在各种损伤因素作用下产生大量促炎因子、减少抗炎因子的结果。机体产生的抗炎因子，能防止炎症反应的损伤，可促进组织修复、对抗促炎因子的作用。

金花茶为广西壮族传统药食资源，相关文献记载金花茶可用于治疗咽喉炎、肾炎等症。且TANWAR A等[10]研究证实，茶的乙醇提取物有相当好的抗炎作用。阎新佳[11]研究发现金花茶叶醇提物对内毒素介导腹腔巨噬细胞炎症损伤具有保护作用。但关于金花茶叶体内的抗炎作用未见文献报道，其祛痰药理研究几乎空白。本课题首次采用酚红排泌法以及耳、足肿胀法研究金花茶叶醇提取物的祛痰以及抗炎活性，并用ELISA法评价小鼠血清中炎性因子TNF-α、IL-6、IL-1β以及IL-17A含量，探讨其发挥抗炎作用的可能机制。研究发现提取物3个剂量组对小鼠气管痰液分泌均具有一定促进作用，能够增加酚红的排泌量，对二甲苯、角叉菜胶局部引起的小鼠耳、足肿胀都具有明显缓解效果(P<0.05)，且高剂量组均优于阳性对照组，表明金花茶叶醇提取物具有较好的祛痰作用。金花茶叶具有丰富的黄酮类成分以及茶多酚类成分，猜测该类成分可能是祛痰、抗炎的药效成分之一，仍有待进一步实验证实。在ELISA实验中，金花茶叶醇提取物能够减少小鼠血清中TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17A的含量水平(P<0.05)，表明金花茶叶的抗炎机制可能是通过抑制炎性细胞因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17A的形成，减少细胞损伤从而保证机体细胞正常运行而发挥作用，起抗炎作用的具体化学成分及其作用特点还有待后续进一步探讨。

二甲苯致小鼠耳肿胀实验的难点在于二甲苯溶液具有毒性且具有挥发性，涂抹小鼠耳朵时可能会不均匀，对小鼠耳朵造成不同程度的肿胀。涂抹二甲苯时，需要精密吸取，控制环境温度等减少二甲苯的挥发。在角叉菜胶致小鼠足肿胀实验中，剪取小鼠足部时需剪取一致的部位，同时，注射小鼠足趾部位、注射角叉菜胶的用量应一致。ELISA实验的难点在于，给小鼠眼球取血时要避免出现溶血的情况，并且成功分离出较多的血清，在测定细胞因子含量时，避免出现点样错误或者稀释错误，并在规定时间内完成反应、含量检测。

4 结论

金花茶叶具有良好的祛痰作用，起作用的药效成分以及作用机制有待深入研究，同时实验结果也表明，金花茶叶具有良好的抗炎作用，抗炎机制可能与抑制炎症因子TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-17A的合成及释放有关。本研究可为金花茶叶的临床应用及其治疗物质基础提供理论依据，而且具有较好的开发价值，至于其有效成分以及药效机制有待今后进一步研究。