甲基丙二酸血症家系的基因诊断与产前诊断*

张菁菁,马定远,孙 云,洪冬洋,刘 刚,王玉国,曾华沙,胡 平,许争峰

[南京医科大学附属妇产医院(南京市妇幼保健院)遗传医学中心,南京 210004]

甲基丙二酸血症(methylmalonic acidemia,MMA)是一种常染色体隐性遗传病，是目前中国最常见的有机酸尿症[1]。MMA的发病率在不同地区有较大差异，亚太地区较低，为0.79/10万，中东和北非地区可达6.04/10万，国内各地发病率约为(1.5～2)/10万[2]。MMA是由于特定的氨基酸(如异亮氨酸、甲硫氨酸、苏氨酸等)、胆固醇和奇数链脂肪酸代谢障碍引起，由于上述代谢途径中的甲基丙二酸辅酶A或其辅酶钴胺素代谢缺陷导致体内甲基丙二酸的蓄积，从而对机体，特别是脑组织产生损伤，引起一系列多样的临床表现，严重时常危及患儿生命。根据是否合并同型半胱氨酸血症，MMA可分为两型：单纯型甲基丙二酸血症和甲基丙二酸血症合并同型半胱氨酸血症，在中国最常见的是合并型MMA[3]。

MMA患者发病年龄跨度较大，临床表现多样，首次就诊时易误诊和漏诊。随着测序技术的快速发展，对MMA患者进行基因检测有助于早期明确诊断和制定治疗方案。研究表明，单纯型MMA多由MUT(OMIM,609058)基因突变引起[4]，合并型MMA中最常见的是由MMACHC(OMIM,611935)基因突变引起的cblC型MMA，其它致病基因还有MMAA、MMAB、MMADHC及HCF1等[5-6]。通过测序技术检测MMA相关基因，早期诊断MMA并对其家系进行产前诊断，对降低出生缺陷率有着较高的临床价值。本研究收集了2016至2020年在南京市妇幼保健院遗传医学中心就诊的35个MMA家系，对其进行基因检测，在明确基因突变位点的前提下，对再次妊娠需要产前基因检测的家系提供产前诊断。

1 资料与方法

1.1 研究对象 2016年1月至2020年12月南京市妇幼保健院遗传医学中心共收集到35例MMA家系，其中30例为MMA合并高半胱氨酸血症患儿家系，5例为单纯型MMA患儿家系。所有患儿的新筛结果中丙酰基肉碱C3，C3/乙酰肉碱C2的比值，C3/游离肉碱C0的比值及尿气相-质谱尿甲基丙二酸结果均超出正常范围。30例合并型MMA患儿血清同型半胱氨酸升高。临床诊断后建议患儿家庭进行基因检测，对于再次妊娠后要求产前诊断的孕妇,采集羊水进行检测。本研究经医院医学伦理委员会批准，所有新生儿筛查、基因诊断及产前诊断工作均取得患儿家长同意并签署知情同意书。

1.2 样本收集与DNA提取 对35例患儿及其父母抽取2mL EDTA抗凝的外周血，需要产前诊断的孕妇再次妊娠18～22周，通过羊膜腔穿刺术抽取15mL羊水。采用DNA提取试剂盒(QIAamp，QIAGEN公司，德国)提取外周血或羊水基因组DNA，Nanodrop分光光度计(ThermoFisher，美国)测定DNA浓度，并且把DNA浓度稀释在10～20ng/μL，OD260nm/280nm比值在1.8～2.0之间。

1.3 目标区域捕获测序及生物信息学分析 目标区域捕获测序是针对目的基因组区域涉及特异性的探针，将其与基因组DNA杂交，富集到目标基因组区域的DNA片段，再利用高通量测序技术进行测序的方法。本研究中将MMA疾病相关的基因MMUT、MCEE、MMAA、MMAB、MMACHC、MMADHC、LMBRD1、ABCD4、HCFC1、GPHN、PCCA以及PCCB基因的外显子区域作为目标基因区域，应用捕获芯片(MyGenostics,GenCap)对这些区域进行捕获。具体步骤：首先将基因组DNA随机打断成片段，与Illumina PE接头寡核苷酸混合物链接，对产物进行链接介导的聚合酶链式反应(LM-PCR)，将扩增纯化后得到的DNA文库与目标基因区域捕获芯片进行杂交富集目标区域序列，通过Illumina Next500测序平台对捕获序列进行测序。将原始测序数据利用伯罗斯-惠勒比软件(BWA,http://bio-bwa.sourceforge.net/)过滤，得到的序列与NCBI数据库中人类基因组参考序列进行比对，利用基因组分析工具包软件(GATK，https://software.broadinstitute.org/gatk/)分析得出单核苷酸变异(SNV)和插入缺失突变的相关信息。然后通过ANNOVAR软件(http://annovar.openbioinformati cs.org/en/latest/)对所有的SNP和插入缺失突变进行注释。通过查阅文献和以下数据库对突变的致病性进行分析：正常人数据库包括千人基因组计划(http://www.1000genomes.or/)、Exome Variant Server(http://evs.gs.Washingto n.edu/EVS/)和EXAC(http://exac.broadinstitute.org/)。错义突变使用SIFT(http://sift.jcvi.org/)，PolyPhen-2(http://genetics.bwh.harvard.edu/pph2/)，MutationTaster(http://www.mutationtaster.org/)和GERP++(http://mende l.stanford.edu/SidowLab/downloads/gerp/index.html)。所有突变均经过Sanger测序验证。根据2015年ACMG遗传变异分类标准和指南[7]，将突变分为致病性变异、可疑致病性变异、临床意义不明变异以及良性变异。

1.4 产前诊断 对于患儿及父母明确基因型的家庭，再次妊娠至18～22周，抽取羊水进行相应突变位点的Sanger测序，并且采用21、18、13和性染色体倍型检测试剂盒(上海晶准生物医药有限公司)进行STR分析以排除母体污染。

1.5 随访 对进行产前诊断的胎儿结局进行随访，对于足月分娩的新生儿进行常规足底血串联质谱筛查，并且进行尿GC-MS检测以及血中同型半胱氨酸检测。

2 结 果

2.1 35例家系中基因突变分析 35例家系患儿中有5例患儿(5/35,14.3%)为MMUT基因突变所致，共包含9种MUT基因突变(表1)，分别为c.323G>A、c.470T>A、c.577A>T、c.693C>G、c.1280 G>A、c.1591delG、c.1610T>A、c.1663G>A以及c.2216_2219del。经查阅文献及软件分析提示c.577A>T、c.1591delG、c.1610T>A以及c.2216_2219del是为新突变。5例家系分析均为复合杂合突变。

35例家系患儿中有30例患儿(30/35，85.7%)为MMACHC基因突变所致，共包含MMACHC基因突变12种(表2)，其中c.609G>A无义突变最常见，占40.3%，其次为c.658_660delAGG缺失突变，占21%，c.482G>A和c.80A>G分别占11.3%和8.1%，无义突变c.79C>T为首次报道的新突变。30例家系中3例为纯合突变，其余均为复合杂合突变。

2.2 产前诊断结果 35例家系中有8对夫妇再次妊娠时接受产前基因检测，首先对采集到的羊水样本进行STR分析排除母血污染，保障基因检测结果的可靠性，再对羊水样本进行家系基因突变的检测。结果提示，8个家系中有2例胎儿为野生型，1例胎儿为杂合突变携带者，5例胎儿基因型与先证者一致，这5个家系中有3个家庭第三次妊娠时羊水基因结果提示2例为野生型，1例为杂合变异携带者。对于基因检测结果与先证者一致的胎儿均终止妊娠，其余野生型和杂合变异携带者均继续妊娠(表3)。

表1 MUT基因突变汇总

表2 MMACHC基因突变汇总

表3 8例家系的产前诊断结果

2.3 随访结果 进行产前诊断的家系在胎儿出生后1月、6月、1年均进行随访，8个家系中经1次或2次妊娠足月分娩的新生儿均接受新生儿足跟血筛查，结果均在正常范围内，且1年随访生长发育均正常。

3 讨 论

甲基丙二酸血症是一种临床表型多样、症状严重的疾病[8]。近年来，各地区陆续报道了本地区范围内的MMA临床筛查和基因检测结果，对该病的防治有着重要的临床意义[9-12]。本研究总结近5年MMA病例的基因诊断和产前诊断结果，共收集35例MMA家系。通过基因检测结果提示5例家系为单纯型MMA，即MMUT基因突变所致；30例家系为cblC型MMA，即MMACHC基因突变所致，并且对8个家系再次妊娠时采集羊水行产前基因检测。该研究为进一步明确本地区甲基丙二酸血症的疾病谱和基因谱提供了参考依据，并且通过产前诊断可有效降低MMA患儿的出生率，减少出生缺陷率。

35例家系中，有30例均为MMACHC基因突变所致的cblC型MMA，占总病例数的85.7%(30/35)，这与以往文献报道一致，即cblC型MMA是中国人群中最常见的类型[13]。MMACHC基因定位于1号染色体p34.1，共包含5个外显子，其中外显子1-4为编码区，共编码282个氨基酸，目前全世界范围内报道的突变大约有一百余种，在白种人群中，c.271dupA为最常见的突变类型，而在中国人群中c.609G>A为cblC型MMA中最常见的突变[14]。Wang等[15]报道，在中国人群中，c.609G>A约占MMACHC基因所有突变的47.63%。于玥等[14]对携带c.609G>A突变的720例MMA患儿临床及随访分析提示，携带该突变的患儿多为出生后1月内发病，且c.609G>A纯合变异的患儿较携带c.609G>A与其它位点的复合杂合变异预后差。本研究中，30例cblC型MMA中共发现12种突变，c.609G>A为最常见类型，约占40.3%，与已报道的文献一致。本研究的突变中，还发现一种新的无义突变c.79C>T，该变异导致氨基酸序列发生p.Gln27Ter突变，该突变在人类基因突变数据库(human gene mutation database,HGMD)无记载，但由于该突变使MMACHC基因的编码信息发生错误，可使编码的蛋白质提前终止，从而导致表达截短形式的蛋白质。此外，查阅正常人群数据库，该变异位点均无记载，评估为罕见变异，该患儿的另一个突变位点为MMACHC基因的经典突变位点c.609G>A，评估其为致病性突变，综合评估c.79C>T新变异为致病性变异。

本研究病例中，除最常见的MMACHC基因所致的cblC型MMA外，5例均为MUT基因突变所致的单纯型MMA。MUT基因定位于6号染色体p12.3，共有13个外显子，编码750个氨基酸。目前全世界范围内已报道的突变类型有近300种，大多数突变仅在一个家系中发现，所以没有明确的热点突变类型[2]。以往研究报道中，在我国较常见的突变位点是c.729_730insTT、c.323G>A以及c.1106G>A，但还需积累更多病例和基因突变信息，确定MUT基因的突变热点[16]。本研究中5个家系共包含9种基因突变类型，其中有4种为新突变：c.577A>T、c.1591delG、c.1610T>A以及c.2216_2219del。对这些新突变进行了致病性评估：(1)c.1591delG为移码突变，可导致氨基酸序列发生p.Glu531 Asnfs*7改变，可使编码的蛋白质提前终止，从而导致表达截短形式的蛋白质，从而影响蛋白功能，在正常人群数据库中记载频率极低，属于罕见变异。且该患儿另一个突变位点为明确致病位点，综合评估该变异为致病性突变。(2)c.1610T>A为错义突变，可导致氨基酸p.Leu537Gln改变，在正常人群数据库中均无频率记载或频率极低，评估属于罕见变异。携带c.1610T>A的患儿另一个突变位点为明确致病变异，且患儿临床表现及血检指标均符合MMA诊断，评估c.1610T>A为可能致病变异。(3)c.577A>T为错义突变，可导致氨基酸p.Ile193Phe改变，在正常人群数据库中无频率记载，属于罕见变异，携带c.577T>A的患儿另一个突变也为新发变异(c.2216_2219del)，所以评估该变异为临床意义不明的变异。(4)c.2216_2219del为移码变异，可导致氨基酸序列发生p.Ile739Argfs*18改变，但该变异位于MMUT基因最后一个外显子，导致甲基丙二酰辅酶A变位酶最后12个氨基酸发生变化，并多延伸5个氨基酸，评估该变异不导致无义介导的mRNA降解，关于该变异是否在蛋白质水平上影响功能未见研究报道，评估该变异为临床意义不明的变异。因此，c.557A>T和c.2216_2219del的致病性还有待进一步的数据及功能实验证实。

串联质谱应用于新生儿遗传代谢病的筛查以及基因诊断MMA的普及以来[17]，MMA患儿能做到早诊断、早治疗[18]，但一些患儿治疗后仍遗留一定的智力或运动障碍，对家庭和社会带来一定的经济和精神负担。因此，孕期的产前诊断显得尤为重要[19]。本研究对明确基因位点的8个家系再次妊娠时采集羊水进行产前基因诊断，有效阻断MMA患儿的出生，对产前基因检测阴性，正常分娩胎儿的随访各项指标均在正常范围内。

本研究总结了近5年MMA患儿的基因检测结果，不仅发现了本地区MMACHC基因的热点突变，并且检测到MMACHC和MUT基因共5种新突变，丰富了MMA患儿的基因突变谱。通过分析，一些新突变被证实为致病或可能致病变异，但有些新突变的致病性还有待更多的病例和功能实验的证实。对已确定基因型的家系提供产前诊断，对避免MMA患儿的出生，降低出生缺陷率有着重要的临床意义。