竞争ELISA法检测布病终止反应后影响OD值的因素探讨

吴 蔚 南平市动物疫病预防控制中心 福建南平 354200

布病，即布鲁氏菌病，是由布鲁氏菌引起的急性或慢性人畜共患病，广泛流行于世界许多国家，被我国列为二类动物疫病。该病主要侵害动物的生殖器官，引起家畜不育、流产等。兽医实验室对布病抗体的检测有许多方法，如虎红平板凝集试验、试管凝集试验、竞争ELISA试验等[1]。竞争ELISA法在实验室检测中以精准、方便、快速、高通量独占优势[2]，2018年已被列入国家标准。而在竞争ELISA法检测过程中，有很多需要注意的步骤，但在终止反应后这一阶段最容易被检测人员忽略[3]。本文就这一步骤中可能影响试验结果的因素（气泡、放置时间等）进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 样本与试剂 经过虎红平板凝集试验初筛后抗体为阴性的牛、羊血清各4份；布鲁氏菌病竞争ELISA检测试剂盒（北京中海生物），试剂盒内的抗体阴性血清、阳性血清。

1.2 仪器 微量移液器、纯水仪、生化培养箱、酶标仪。

1.3 方法

1.3.1 终止反应前的试验操作 将牛、羊血清（各4份，共计8份）以及阴性、阳性标准血清（各1份，共计2份）作为待检血清按照试剂盒说明进行检测，同时设置阴性、阳性对照（各2孔），具体步骤大致为：在包被板上加样 （50μL/孔）、加酶标二抗（50μL/孔）以及抗体工作液（100μL/孔），盖板，37℃避光温育；洗板4次，加入底物（100μL/孔），盖板，37℃避光温育10 min，加入终止液。

1.3.2 终止反应后的试验操作 在加入终止液终止反应后，立即用酶标仪在波长450 nm下测定各反应孔的吸光度OD值，之后用微量移液器将各反应孔快速打出气泡，测定其吸光度OD值，然后再用吸头戳破气泡，15 min再次测定各反应孔中的吸光度OD值。

2 结 果

由表1可见，在同一个反应孔中若产生气泡，其OD值增大；随着时间延长，其OD值也变大。而在戳破气泡静置15 min后反应孔OD值反而小于之前有气泡时的OD值。

表1 不同处理后各样本OD值

将打出气泡的样本OD值、戳破气泡静置15 min的样本OD值分别与样本初始（无气泡）OD值作配对样本t检验，结果见表2。t值分别为-4.701、-5.778；P（Sig.）分别为0.001、0.000，均小于0.05，差异显著。

表2 不同处理的配对样本t检验

3 讨 论

本试验探讨了竞争ELISA法检测布病抗体时在试验终止阶段可能出现影响结果的因素，在用该方法检测前已使用虎红平板凝集试验对样品做过初筛，结果均为阴性。考虑到需要抗体阳性作对比，因此，用试剂盒中的阳性对照，即多做一孔作为阳性孔进行对比。

结果表明，无论是阴性还是阳性的反应孔，在加终止液后，反应孔内若存有气泡，会使得该孔的吸光度OD值明显变大，从而影响结果的判定。产生气泡的原因有很多，在移液或洗板阶段均有可能发生。因此，移液时应尽量准确，用力均匀，不要过快、过猛带入空气导致气泡的产生；洗板阶段，洗涤结束后也应在吸水纸上拍干，避免气泡残留。若反应孔出现气泡，要及时处理，可用微量移液器的吸头将其戳破。终止反应后，随着放置时间延长，会增加反应孔的OD值，但在戳破气泡静置15 min后的反应孔OD值反而小于之前有气泡时的OD值，说明放置时间对OD值的影响稍小于存有气泡。本试验采用的试剂盒要求在终止反应的5 min内测定结果，但本试验在15 min后测定的结果仍满足试验成立的条件。一般的ELISA检测中，要求加入终止液的15 min内测定样品OD值，最好是加完终止液混匀后马上测定，这是由于在加入终止液后，显色剂在光的作用下有时仍然会出现非特异显色，造成误差。因此，在日常的ELISA试验过程中，最好提前（15 min以上）做好酶标仪的开机预热与调试工作，以免终止反应后不能及时读数，导致结果出现偏差。