miR-210、BDNF在肾上腺嗜铬细胞瘤中的表达及其临床意义

余 晓 莉

(洪湖市中医医院检验科 洪湖 433200)

肾上腺嗜铬细胞瘤(Pheochromocytoma，PPC)作为一种神经内分泌肿瘤，发病率较低，恶性肿瘤的5年生存率偏低，但早期的临床表现及影像检查较难诊断肿瘤的恶性程度，容易延误病情，影响患者预后[1]。因此，对PPC进行研究，提高术后预后效率对PPC临床治疗具有重要意义。微小RNA-210(microRNA-210，miR-210)隶属于miRNA，与血管新生及颈动脉宽窄程度有关，能够在缺氧条件下稳定表达，在心脑血管疾病及恶性肿瘤中已有大量研究[2]。脑源性神经营养因子(bain-derived neurotmphic factor，BDNF)作为一种神经生长因子，与机体的应激反应及情绪障碍等过程相关，并参与神经元的生长分化过程[3]。BDNF与肿瘤的发生密切相关，因此在各种恶性肿瘤的疾病进展中被大量研究，但RNA-210和BDNF与PPC发生的相关研究不多，本研究将检测PPC患者中miR-210和BDNF表达水平，分析miR-210和BDNF表达与患者临床病理的关系，并评估miR-210、BDNF表达对PPC的术后预后结局的价值，对改善PPC术后预后具有重要意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2011年5月-2014年12月在本院进行诊治的91例PPC患者(研究组)作为研究对象，并收集患者肿瘤直径、组织分化程度、有无淋巴结转移等资料；另收集35例同期健康志愿者(对照组)的正常肾上腺髓质组织标本作为对照，两组性别组成比例、年龄、BMI等方面比较，差异均无统计学意义(P>0.05)，见表1。

表1 两组患者一般资料比较

纳入标准：(1)病理诊断为PPC患者；(2)病史资料完整者；(3)没有肿瘤切除手术史者；(4)均签署知情同意书。排除标准：(1)合并其他肿瘤患者；(2)有精神疾病者；(3)医院伦理委员会审核并批准本研究；(4)中途失访者。(伦理批号20161209)。

1.2 检测方法

RNA提取试剂盒(北京索莱宝科技有限公司)提取所有研究对象的肾上腺髓质组织中的总RNA，后反转录得cDNA。采用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)法检测miR-210和BDNF表达水平。Two Step Stemaim-it miR qRT-PCR Quantitation Kit(SYBR Green)试剂盒(上海诺伦生物医药技术有限公司)配备qRT-PCR反应体系(SYBR®Green Mix 7.5 μL，cDNA1μL，上下游引物(10 μM)各0.5μL，使用ddH2O 补至15μL)；扩增应用定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)，条件为95℃，60s；95℃，10s；63℃，5s；72℃，10s；32个循环。具体引物序列见表2。采用2-ΔΔCT法对miR-210和BDNF表达水平进行定量分析。

表2 qRT-PCR引物序列

根据miR-210表达水平，将PPC患者分为miR-210低表达组(miR-210低于或等于均值，45例)和miR-210高表达组(miR-210高于均值，46例)；根据BDNF表达水平，将PPC患者分为BDNF低表达组(BDNF低于或等于均值，48例)和BDNF高表达组(BDNF高于均值，43例)。

1.3 随访

通过复诊和电话方式对患者进行随访，随访时间为患者术后1～60个月，直到随访时间截止或患者死亡为止。

1.4 统计学分析

2 结果

2.1 研究组与对照组miR-210和BDNF表达水平比较

相对于对照组，研究组患者miR-210和BDNF表达水平明显较高，且差异具有统计学意义(P<0.05)，见表3。

表3 两组患者miR-210和BDNF表达水平比较

2.2 miR-210和BDNF表达水平在不同临床病理特征中的比较

miR-210和BDNF在不同临床病理特征中的表达水平中均具有统计学意义，其中肿瘤直径<3cm、中高分化、无淋巴结转移患者、良性肿瘤患者miR-210和BDNF水平均较低(P<0.05)，见表4。

表4 miR-210和BDNF表达水平在不同临床病理特征中的比较

2.3 PPC患者miR-210和BDNF表达水平的相关性

Pearson法分析结果显示，PPC患者miR-210和BDNF表达呈明显正相关关系(r=0.445(P<0.05))，见图1。

图1 PPC患者miR-210和BDNF表达水平的相关性

2.4 miR-210和BDNF表达水平与PPC患者术后预后的关系

Kaplan-Meier生存分析显示，miR-210和BDNF表达均与总生存时间相关。91例患者中有61例患者5年后存活。miR-210低表达、高表达组PPC患者的5年预后生存率分别为82.8%、52.2%，miR-210低表达组的生存率明显高于miR-210高表达组(χ2=10.854，P=0.001)，见图2。BDNF低表达组、高表达患者的5年预后生存率分别为87.5%、44.2%，BDNF低表达组的生存率明显高于BDNF高表达组(χ2=21.386，P=0.000)，见图2。

图2 miR-210、BDNF表达与PPC患者术后预后的关系

2.5 影响PPC术后预后不良的因素分析

COX分析显示，miR-210和BDNF高表达、组织低分化、有淋巴结转移、肿瘤直径≥3cm、肿瘤恶性是影响PPC预后不良的独立危险因素(P<0.05)，见表5。

表5 影响PPC预后不良发生的因素分析

3 讨论

PPC仅发生于肾上腺内，是在病变组织中能够产生并分泌儿茶酚胺，致使临床出现高血压、头晕、心悸等症状[4]。PPC患者术后预后数据显示，良性PPC患者的5年生存率大于95%，而恶性PPC患者约44%[5]。但由于PPC患者临床症状没有特异性，且单从嗜铬细胞瘤形态上的差异也难以诊断为恶性肿瘤或良性肿瘤，因此常出现误诊及延误就医等现象，导致患者术后难以开展有针对性的辅助治疗，影响术后生存结局[6]。因此预测PPC术后5年预后结局，以提前采取措施改善预后具有重要意义。本研究对PPC患者miR-210和BDNF表达水平进行分析，评估分析miR-210和BDNF表达水平对PPC患者的术后预后价值，以期为PPC深入研究及术后预后提供理论基础。

miR-210是一种与细胞分裂、代谢、迁移侵袭有关的缺氧诱导的miRNA分子，参与线粒体代谢、DNA损伤应答、细胞增殖凋亡等重要生理过程[7]。miR-210具有致癌性，近几年在多种癌症中被大量研究，如肾细胞癌、肺癌、乳腺癌等恶性肿瘤疾病等。在胶质瘤中miR-210能够提高胶质瘤细胞侵袭能力，表现为高表达且与病理分级有关[8]。miR-210表达在肾细胞癌中上调促进了肾小管上皮细胞的增殖、侵袭和迁移能力，抑制肾小管上皮细胞的凋亡[9]，并且在鼻咽癌中，抑制miR-210表达，能够提高鼻咽癌放抗细胞的敏感性[10]。LUAN等[11]研究发现，miR-210在缺氧诱导条件下在嗜铬细胞中过表达，通过PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制BNIP3表达保护肾上腺嗜铬细胞瘤(PC-12)细胞免受低氧损伤。然而，RUFF等[12]研究发现，较低的血清miR-210表达水平与恶性嗜铬细胞瘤或副神经节瘤显著相关。以上研究结果表明，miR-210在肾上腺嗜铬细胞瘤中的作用仍充满争议。本研究结果表明较之于对照组，研究组患者miR-210表达水平明显升高，且miR-210表达水平在不同肿瘤直径及分化程度、有无淋巴结转移、肿瘤恶性程度患者中表达水平出现显著差异，提示miR-210与PPC的发生和发展存在某种联系。绘制Kaplan-Meier生存分析曲线，显示miR-210表达与总生存时间相关，miR-210低表达、高表达组PPC患者的5年预后生存率分别为82.8%、52.2%，miR-210低表达组的生存率明显高于miR-210高表达组，且miR-210高表达是影响PPC术后预后不良的独立危险因素，miR-210可能通过某种机制参与PPC的发生发展，预示了miR-210有望成为PPC术后预后的生物标志物，对PPC深入研究提供基础。

BDNF能够与其受体结合参与机体的应激反应和情绪障碍等过程，在神经发育中起重要作用，并与肿瘤的形成相关。异常高表达的BDNF能够激活磷脂酰肌醇-3激酶信号通路，促进恶性肿瘤的发生与转移，因此在多种肿瘤疾病中被大量研究[13]。BDNF不仅能够提高食管癌细胞增殖能力，还能促进其侵袭[14]。卵巢癌组织中BDNF为高表达，且与临床分期、组织分化和卵巢癌的预后有关[15]。此外BDNF诱导嗜铬细胞释放去甲肾上腺素和多巴胺等，儿茶酚胺能使PPC患者产生头晕等症状[16]。目前，针对BDNF在PPC中的相关研究较少，本研究对PPC患者中BDNF表达水平进行研究，结果显示BDNF在研究组中的表达水平显著高于对照组，且miR-210和BDNF表达呈显著正相关。研究表明，下调BDNF能够缓解通过miR-210下调引起的背根神经节神经毒性[17]。而范海玲等[18]研究显示，运动训练干预增加miR-210、BDNF表达可共同促进脑组织VEGF表达，减轻脑缺血缺氧后神经损伤。因此推测BDNF可能与miR-210共同参与PPC的发生发展。对BDNF表达水平与不同病理症状之间的比较发现，在有淋巴结转移、肿瘤直径≥3cm、中高分化、肿瘤恶性患者中，BDNF表达水平显著升高，提示BDNF可能与PPC患者病情发展有密切关系。绘制Kaplan-Meier生存分析曲线，显示BDNF表达与总生存时间相关，BDNF低表达组、高表达患者的5年预后生存率分别为87.5%、44.2%，BDNF低表达组的生存率明显高于BDNF高表达组，且BDNF高表达是影响PPC术后预后不良的独立危险因素，提示BDNF对PPC术后预后有一定预测价值，能为PPC的术后预后提供理论依据。

综上所述，miR-210和BDNF在PPC患者中高表达，与PPC的发生及预后具有密切关系，且二者高表达及有淋巴结转移、肿瘤直径≥3cm、组织低分化、肿瘤恶性是影响PPC术后预后不良发生的独立危险因素，有望成为PPC术后预后的生物标志物。但本研究对照组样本量较少，且对miR-210和BDNF在PPC中的作用机制尚未明确，后续需增加样本量对miR-210和BDNF在PPC中进行深入研究。