响应面法优化微波-超声波协同提取黑枸杞叶多酚及抗氧化性研究

何若男，刘思师，吴婷，曾颖，陈建福，陈雅欣，陈仲巍

（1.厦门医学院，天然化妆品福建省高校工程研究中心，福建 厦门 361023；2.厦门医学院，药学系，福建 厦门 361023；3.漳州职业技术学院食品工程学院，福建 漳州 363000）

枸杞叶别称地仙苗、天精草，自古便为我国药食两用植物，营养价值居于食物前列。枸杞叶富含有多糖类[1]、甾体类及包括黄酮类[2]在内的各种酚酸类[3]、氨基酸与精胺类、褪黑素、甜菜碱和类胡萝卜素等类型丰富的营养物质及资源性化学成分[4-6]。已有研究证实，枸杞叶在抑菌、神经保护[7]、抗氧化、调血脂[8]、降血糖[9]、抗肿瘤和增强机体免疫等方面展现生物学活性。OLATUNJI[10]发现枸杞叶乙酸乙酯提取物可通过调节氧化应激来实现降血糖和降血脂，其中，酚酸类作为活性功能成分能够提升胰岛素敏感性，同时抑制着由高血糖所介导的肾脏氧化应激以及炎症反应，以此缓和糖尿病致使的肾损伤[8]，并起到糖尿病的预防和治疗作用。此外，枸杞叶含有的多酚类成分也展现出了显著的抗氧化活性[11]，LEE S R等[12]以高糖诱导炎症并患有高脂的小鼠为样本，对其饲喂掺杂枸杞叶的饲料后发现，小鼠肠道上皮细胞间的紧密连接完整性得以增加，一氧化氮的产生减少，同时内质网（ER）应激和炎症反应得到抑制，凸显了其抗氧化与抗炎功效。已有研究证实，枸杞叶中黄酮类成分的含量可超出枸杞果实近10倍[13]，黑果枸杞芽茶的总多酚、总黄酮和氨基酸含量显著高于红果枸杞叶茶[14]，故而，黑枸杞叶成为了当前的一种食品新资源。时至今日，枸杞资源相关产业在国家战略和群众的支持下发展迅猛[15]，种植面积逐年扩增，已逐步成为我国西北部特色支柱产业之一。而枸杞叶作为枸杞果药材的副产物，除少部分作为枸杞芽茶市售，每年都有近百万吨被废弃，造成资源浪费。因此，对枸杞叶的资源价值进行开发和工业化研究，在符合我国乡村振兴的同时，具有良好市场和可持续发展前景。

微波辅助萃取作为近年发展、推广的一种新型技术得到广泛研究。微波以其非电离的电磁辐射作用力对样品的氢键以及分子间作用力造成破坏，同时可使样品的溶质溶液内外均匀受热，助力于短时内高效溶浸出样品细胞的胞内容物。超声波作为广泛长期使用的一种传统提取方法，其用于诸如多酚类物质的萃取时，主要由其强大的空化作用和振动效应对样品产生冲击波作用力及猛烈的机械效应，迅速破坏细胞壁溶出胞内物质，以此提高传质速率[16]。二者结合，相辅相成下优势结合可将提取效率大幅提升，同时摒弃了传统热水浸提法耗时久、易糊化的缺点，与酶提取法相比成本也大幅降低，具有低化学试剂用量、操作简便、短时高效和成本低廉等优势。此外，该法尤其在性质不稳定的天然产物提取中展现出明显优势[17]。本研究采取微波 超声波协同提取试验方式，探索各因素对黑枸杞叶总多酚萃得率的影响，并以响应面法探索确定最佳条件，为黑枸杞叶的资源开发再利用研究提供参考和理论支持。

1 材料与方法

1.1 材料和仪器

红枸杞叶、黑枸杞叶分别采摘自福建漳州南靖6.5年生的枸杞成树，选取无虫害、无机械损伤的新鲜叶片（由厦门医学院中药学实验师张娜鉴定）；没食子酸、Tris、福林酚、L（+）-抗坏血酸（分析纯）A8100（北京索莱宝科技有限公司）；DPPH自由基[分析纯，梯希爱（上海）化成工业发展有限公司]；邻苯三酚、无水碳酸钠、水杨酸、氢氧化钠、无水乙醇、硫酸亚铁（分析纯，国药集团化学试剂有限公司）。粉碎机（广州市旭朗机械设备有限公司XL-10B）；电子分析天平（sartorius BSA2202S-CW）；微波超声波萃取仪（Xinyi-2A升级款）；台式高速离心机[Sigma离心机（扬州）有限公司3K15]；酶标仪（BioTek EPOCH/2）；超低温保存箱（青岛海尔生物医疗股份有限公司DW-25L262）；pH计（EUTECH pH700）。

1.2 实验方法

1.2.1 黑枸杞叶粉的制备 挑选无腐烂、无虫害的新鲜黑枸杞叶，清洗晾干后置于65℃电热鼓风干燥箱干燥至恒重，放入万能粉碎机粉碎并过80目（180um）筛，所得干物质放置于干燥器内避光密闭保存。

1.2.2 黑枸杞叶多酚类物质提取方法 称取经预处理的黑枸杞叶粉末（1.00±0.05）g共3份分别放置于3个微波 超声50 mL容器内，混合以相应料液比的提取溶剂，采用超声波 微波协同反应系统（恒定70℃）萃取一定时间，后经5 000 r/min旋转离心5min分离留取上清液，以福林 酚比色法测定黑枸杞叶多酚类物质含量。

1.2.3 总酚标准曲线的绘制及黑枸杞叶总酚含量测定 参考刘皓涵等[18]的方法，采取福林 酚比色法，略加改动。以0.2 mL为固定间隔等梯度取样新鲜预配置的标准工作试液（100 mg/L的没食子酸标准品溶液）0～1.4 mL，反应后测定吸光度值，并以此绘制该标准曲线。同等条件下以相同方法，精确吸取适量的黑枸杞叶萃取样品液，测定并记录其对应吸光度后代入以下标准公式计算得黑枸杞叶萃取样品溶液得总酚物质含量m。

上式中A为所测黑枸杞叶样液吸光度值；0.003 8为空白吸光度值；d为样液稀释倍数；v为样液体积，mL；0.064 8为没食子酸标准曲线的斜率。

1.2.4 黑枸杞叶总酚超声波-微波协同萃取单因素实验 以黑枸杞叶多酚提取率为因变量，分别以料液比、微波功率、萃取时间、超声功率和乙醇体积分数为考察因素，参考1.2.2的提取方法，独立探究各单因素对黑枸杞叶多酚提取率的影响。

1.2.4.1 料液比对黑枸杞叶多酚提取量的影响 以固定温度70℃[19]、乙醇体积浓度60%、超声功率和微波功率均200 W、萃取时间10 min条件下，设置5个液料比（乙醇/黑枸杞叶粉，mL/g）水平（10、15、20、25和30），平行提取3次，考察对黑枸杞叶多酚提取量的影响。

1.2.4.2 微波功率对黑枸杞叶多酚提取量的影响 以固定温度70℃[19]、乙醇体积浓度60%、超声功率200W、液料比（乙醇/黑枸杞叶粉，mL/g）水平25:1，萃取时间10 min条件下，设置5个微波功率（W）水平（100、200、300、400和500），平行提取3次，考察对黑枸杞叶多酚提取量的影响。

1.2.4.4 萃取时间对黑枸杞叶多酚提取量的影响 以固定温度70℃[19]、乙醇体积浓度60%、超声功率及微波功率均200 W、液料比（乙醇/黑枸杞叶粉，mL/g）水平25:1条件下，设置5个提取时间（min）水平（6、8、10、12和14）平行提取3次，考察对黑枸杞叶多酚提取量的影响。

1.2.4.3 乙醇体积分数对黑枸杞叶多酚提取量的影响 以固定温度70℃[19]、超声功率及微波功率均200 W、液料比（乙醇/黑枸杞叶粉，mL/g）水平25:1、萃取时间10 min条件下，设置5个乙醇体积分数（%）水平（40、50、60、70和80）平行提取3次，考察对黑枸杞叶多酚提取量的影响。

1.2.4.5 超声功率对黑枸杞叶多酚提取量的影响 以固定温度70℃[19]、乙醇体积浓度60%、微波功率200W、液料比（乙醇/黑枸杞叶粉，mL/g）水平25:1，萃取时间10 min条件下，设置5个超声功率（W）水平（100、200、300、400和500），平行提取3次，考察对黑枸杞叶多酚提取量的影响。

1.2.5 响应面实验 在单因素实验的基础上，选取对黑枸杞叶总多酚提取有显著影响的时间、微波功率及超声功率3个因素，以黑枸杞叶总酚提得率为响应值来进行中心组合试验设计，该试验水平编码及试验因素见表1。

表1 响应面设计因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface methodology

1.2.6 黑枸杞叶体外抗氧化能力的测定 称取等量的黑枸杞叶和红枸杞叶，以同样的方式分别进行总酚提取，随后在适当的梯度稀释后得到待测黑枸杞叶和红枸杞叶样品。

1.2.6.1 黑枸杞叶提取液对DPPH自由基的清除能力 参照SONG等[20]的方案略作修缮，将精准配制的一系列梯度浓度黑枸杞叶、红枸杞叶的新鲜样液分别装入试管，取等体积当日新鲜配置的DPPH溶液（0.2 mM）于暗处避光混合均匀，即刻测定其在517 nm波长处的吸光值标记为A1，25℃于暗处避光恒温反应40 min随后测定标记为A0，对照组替换红枸杞叶样液、黑枸杞叶样液为去离子水测定得A2。以K1（%）表示其DPPH清除率。

1.2.6.2 黑枸杞叶提取液对羟自由基的清除能力 参考刘皓涵等[18]的方案略作修改，精准移取新鲜配制的一系列浓度黑枸杞叶和红枸杞叶提取样液分别与等体积1.76 mM的FeSO4（当日新鲜配置）、等体积1.76 mM的水杨酸-乙醇（其以50%乙醇为溶剂）均匀混合，随后加入等体积1.76 mM的H2O2（加入即刻启动反应），37℃避光恒温反应至30 min后，即刻测定其于510 nm波长处的吸光值并标记为A'1。以红枸杞叶/黑枸杞叶样液与3倍体积无水乙醇均匀混合测定吸光值标记为A'0，以蒸馏水替代红枸杞叶/黑枸杞叶样液为空白对照标记为A'2。以K2（%）表示其羟自由基清除率。

2 结果与分析

2.1 黑枸杞叶总多酚提取单因素试验

2.1.1 微波功率对黑枸杞叶总多酚提取量的影响 由图1可知，随着微波功率逐步增加，黑枸杞叶总多酚的萃得率显示出早期增加后期降低的态势，此因微波作用影响破坏了一部分氢键以及分子间作用力，破坏了黑枸杞叶细胞，而随着该作用力进一步增强，会促使部分植物多酚物质被同步损坏[21]、提取溶剂进一步挥发，且提取温度变得更难以控制，需要更多的间歇时长以保持温度恒定，进而致使萃得量下降。微波功率达到200 W时，提得量最高达4.39 mg/g，因故，最适微波功率选取200 W为宜。

图1 微波功率对黑枸杞叶多酚提取量的影响Fig.1 Effects of microwave power on the extraction of polyphenols from black wolfberry leaf

2.1.2 液料比对黑枸杞叶总多酚提取量的影响 由图2可得知，随着液料比的增加，黑枸杞叶总多酚得率先增加后降低，这是由于初期黑枸杞叶细胞中多酚物质与提取溶剂乙醇的浓度差与接触面积逐步增大，且溶剂分子愈多，则超声波作用下的传质动力也愈大，进而助力多酚类物质的溶解及浸出[22]，后期则有更多的杂质被溶出影响了目标物的提取，且过分剧烈的空化效应及超声作用力也将黑枸杞叶胞内多酚物质破坏。当液料比为20:1（mL/g）时，其萃得量最高可达4.72 mg/g。当液料比超出20:1（mL/g）时，或因其余溶解物的竞争性抑制致使萃得率减少。故而，黑枸杞叶多酚萃取的最适液料比选取20:1（mL/g）为宜。

图2 液料比对黑枸杞叶多酚提取量的影响Fig.2 Effects of liquid-material ratio on the extraction amount of black wolfberry leaf

2.1.3 提取时间对黑枸杞叶总多酚提取量的影响 由图3可看出，随着萃取时间的延长，黑枸杞叶总多酚的得率呈现6～12 min增加，随后再降低的态势。初期随着协同萃取时长的增加，更多的细胞被破坏使得目标黑枸杞叶多酚物质溶出，而随着时间的进一步增加，目的萃取物也被破坏。协同萃取时间达到12 min时，萃得量最高达4.16 mg/g。

图3 时间对黑枸杞叶多酚提取量的影响Fig.3 Effect of extraction time on the extraction of polyphenols from black wolfberry leaf

2.1.4 乙醇体积分数对黑枸杞叶总多酚提取量的影响 由图4可看出随着提取溶剂乙醇所占体积分数的增加，黑枸杞叶总多酚得率先增加后降低，前期的增加是由于溶质分子的存在有助于其余溶质分子的溶出，进而助力于黑枸杞叶多酚类物质的浸出[23]，乙醇体积分数为50%时，其提取量最高达4.34 mg/g。

图4乙醇体积分数对黑枸杞叶多酚提取量的影响Fig.4 Effect of ethanol volume fraction on the extraction of polyphenols from black wolfberry leaf

2.1.5 超声功率对黑枸杞叶总多酚提取量的影响 由图5可看出，随着超声功率的提高，黑枸杞叶总多酚的萃得率在100～400 W持续增加，或因超声波的强大机械与空化作用力破坏了黑枸杞叶的细胞壁及细胞膜、细胞间质，促使其胞内物质迅速溶解释放。当功率超出400 W后，过分大的作用力又促使着其酚类物质更多地发生了包括聚合、氧化在内的化学反应[24]，与此同时对黑枸杞叶中诸如邻二酚羟基等[25]多酚类物质的化学结构造成损坏，降低了萃取率。因而，选取超声功率400 W为该提取液的最宜条件，试验表明其最高提取量达5.622 mg/g。

图5 超声波功率对黑枸杞叶多酚提取量的影响Fig.5 Effects of ultrasonic power on the extraction of polyphenols from black wolfberry leaf

2.2 响应面优化黑枸杞叶多酚提取试验

2.2.1 响应面实验 结合单因素实际结果，将影响较小的乙醇体积分数设置为50%不变，液料比设置为20:1（mL/g）不变，同时固定萃取温度为70℃，选用超声功率、微波功率、时间为自变量，以黑枸杞叶总多酚萃得量（率）为响应值进行优化。具体试验方案及结果分析见表2。本试验采用Design-Expert 12.0软件对表2所示结果值进行响应面回归分析，获得黑枸杞叶总多酚萃得率为响应值的二次多项回归模型为：Y=5.83 0.067 4A 0.199 4B 0.311 0C+0.204 6AB+0.209 3AC 0.282 4BC 0.611 3A20.396 2B20.684 5C2，由二次项系数皆为负数可知，抛物线开口朝下，拥有极大值点。表3所示的方差分析结果表明：模型回归为极显著（P＜0.000 1），失拟项为不显著（P＞0.05），预示外界其余因素对该试验结果干扰并不显著。模型的决定系数为R2=0.983 4，表明实际测试所得数据与回归方程之间展现良好吻合关系，能够较好反映出黑枸杞叶多酚萃得量与超声功率、微波功率与萃取时间的关系。同时可知，各因素对萃得率的影响大小为：C＞B＞A，且一次项B和C、交互项BC、二次项A2、B2及C2对萃得率有极显著影响（即P＜0.01）；交互项AB、AC对萃得率有显著影响（即P＜0.05）。

表2 Box-Behnken试验设计与结果Table 2 experimental design and results of Box-Behnken

表3 回归模型方差分析Table 3 Variance analysis of the regression model

2.2.2 响应面图分析 根据2.2.1中回归方程二次模型所制作的黑枸杞叶总酚提取模型响应面立体分析图和等高线图见图6和图7。图6和图7分别反映了3个因素（超声功率、微波功率和萃取时间）两两交互作用情况下对响应值的影响，若等高线坡度较为平缓、状似圆形表明该两种因素之间交互作用较不显著[21,24,25]，若坡度陡峭、排列紧密且状似椭圆形则表示二因素之间的交互作用相对明显[19,22]。由图6、图7可得，时间和萃取微波功率、超声功率为0水平时，随着各水平因素的变化黑枸杞叶多酚提取量呈现出先上升后下降的趋势。由等高线图可知，超声功率与萃取时间的响应面相对更为陡峭，同时等高线状似椭圆，说明二者间的交互作用强烈[20]，于黑枸杞叶总萃得率的影响极显著；微波功率与萃取时间、微波功率与超声功率的响应面相对平缓，等高线形状更近圆形，说明交互作用相对较小，但仍交互作用显著。此结论与表3所示方差分析P值等结果一致。

图6 时间与微波功率对黑枸杞叶多酚提得量的交互影响Fig.6 Interaction effects of time and microwave power on the extraction amount of polyphenols from black wolfberry leaf

图7 时间与超声功率对黑枸杞叶多酚提得量的交互影响Fig.7 Interaction effects of ultrasonic power and extraction time on the extraction amount of polyphenols from black wolfberry leaf

图8 微波功率与超声功率对黑枸杞叶多酚提得量的交互影响Fig.8 Interaction effects of microwave power and ultrasonic power on the extraction amount of polyphenols from black wolfberry leaf

2.2.3 验证试验 对优化后的黑枸杞叶多酚提取方程求解，得出试验分为内最佳条件：微波功率187.498 W、萃取时间为11.596 min、超声功率378.76 W；实际试验条件下最佳提取工艺为：微波功率190 W、萃取时间为11.6 min、超声功率380 W。重复3次试验，黑枸杞叶多酚平均提取量为6.02 mg/g，与预测值基本拟合，表明该优化模型可靠。

2.3 黑枸杞叶/红枸杞叶提取物体外抗氧化活性

2.3.1 DPPH自由基清除能力 如图9所示，黑枸杞叶和红枸杞叶两种枸杞样品叶均具备DPPH自由基清除能力，且该清除力的强弱与两样品提取液浓度呈现显著正相关性，表明二者均具有抗氧化活性。其中黑枸杞叶样品的上升幅度更为明显，在同样浓度时，黑枸杞叶提取液的体外DPPH自由基清除能力均高于红枸杞叶。

图9 红枸杞叶与黑枸杞叶总多酚提取物对DPPH自由基清除能力对比Fig.9 The scavenging ability of red wolfberry leaf extract and black wolfberry leaf extract on DPPH free radical

2.3.2 羟基自由基清除能力 如图10，羟自由基清除能力也随着黑枸杞叶和红枸杞叶样品浓度的增加而明显提升。在总酚质量浓度均为80ug/mL附近时，红枸杞叶、黑枸杞叶的总酚提取物体外对OH的清除能力分别为70%和78%，清除力百分比增长明显放缓，这或许与硒元素的量增加放缓有关[24-26]。

图10 红枸杞叶与黑枸杞叶总酚提取物对羟自由基的清除能力比较Fig.10 The scavenging ability of red wolfberry leaf extract and black wolfberry leaf extract on hydroxy free radical

3 结论

3.1 本研究采取微波 超声波协同萃取法，以乙醇为提取溶剂探索超声功率、微波功率、时间、乙醇体积分数和料液比5个因素作为自变量时对黑枸杞叶多酚提取率的影响，随后采取响应面法优化黑枸杞叶中多酚提取率，获知最佳工艺参数为：在温度为70℃、乙醇体积分数50%、液料比20:1（mL/g）时，微波功率190 W、萃取时间为11.6 min、超声功率380 W条件下多酚提取率为6.02 mg/g，与预测值接近，表明该模型能够用于黑枸杞叶多酚提取工艺优化。

3.2 通过对黑枸杞叶和红枸杞叶中总酚提取物的体外抗氧化能力测定表明，黑枸杞叶的羟自由基清除率及DPPH自由基清除率均全面优于红枸杞叶，可为黑枸杞叶的开发再利用提供理论支持。