淫羊藿苷对顺铂诱导的小鼠急性肾损伤保护作用及其作用机制研究

赵建通，刘文瞻，万洪磊，路志民，郭明涛，王冰，肖波

（邯郸市第一医院泌尿外科河北 邯郸056000）

顺铂（Cisplatin,CDDP）是一种广泛应用于肺、睾丸和卵巢癌等实体恶性肿瘤的临床化疗药物，具有强烈的肾毒性，由CDDP诱导的急性肾损伤（Acute kidney injury,AKI）限制了该类药物的应用[1-3]。据统计约有1/4的接受CDDP化疗的患者出现了AKI症状[4]。淫羊藿苷（Icariin,ICA）是中草药淫羊藿的主要活性成分之一，为8-异戊烯基黄酮苷类化合物。ICA具有抗炎，免疫调节，补肾壮阳、抗衰老等功效[5,6]。在之前的研究中已经报道了ICA对肾脏疾病的治疗作用，但有关ICA对CDDP诱导的急性肾损伤研究仍然较少[7,8]。本研究通过建立顺铂诱导的小鼠急性肾损伤模型，探究淫羊藿苷对急性肾损伤的保护作用。

1 材料与方法

1.1 动物

40只9周SPF级C57BL/6雄性小鼠，体重（27±2）g，购自浙江省实验动物中心，许可证编号：SYXK（浙）2021-0040。

1.2 药品与试剂

顺铂注射液（货号:SC5170），溶于0.9%生理盐水，购自北京索莱宝科技公司。淫羊藿苷粉末（货号:S2312），纯度＞99.05%，溶于0.9%生理盐水，购自Selleckchem公司；白细胞介素-1（Interleukin-1,IL-1）、白细胞介素-6（Interleukin-6,IL-6）、白细胞介素-10（Interleukin-10,IL-10）及转化生长因子-（transforming growth factor-,TGF-）等酶联免疫吸附（ELISA）试剂盒，购自上海仁捷生物科技有限公司；磷酸化核因子（p-p65）多抗、I B多抗、-肌动蛋白（-actin）多抗及山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗购自上海碧云天公司。

1.3 仪器

CX23光学显微镜，日本奥林巴斯株式会社；Synergy H4全功能酶标仪，美国Bio Tek公司；ChemiDoc XRS化学发光成像分析系统，美国Bio-Rad公司。

1.4 动物模型建立及分组[7,9,10]

将40只C57BL/6小鼠随机分为对照组（Control），淫羊藿苷组（CIA），顺铂模型组（CDDP），淫羊藿苷治疗组（CDDP+CIA），每组10只。老鼠生长与12/12 h的明暗周期环境中，温度（23±1）℃，湿度50%±5%，自由采食，自由饮水，适应性饲养1周。Control组腹腔注射等剂量0.9%生理盐水，CIA组灌胃20 mg/kg淫羊藿苷，连续7 d，CDDP组一次性腹腔注射13 mg/kg CDDP。CDDP+CIA组在腹腔注射CDDP 5 d后连续灌胃20 mg/kg淫羊藿苷7 d。

1.5 血清中BUN、Scr检测

实验结束收集小鼠血液样本。小鼠血清Scr及BUN水平用标准试剂盒检测（南京建成），依据说明书进行操作[11]。

1.6 肾脏指数计算

实验结束后处死小鼠，取小鼠肾脏称重，小鼠肾脏指数计算=小鼠肾脏重量/小鼠体重重量。

1.7 苏木精 伊红染色观察肾脏中组织病理学变化

处死小鼠后，将小鼠肾脏浸入4%多聚甲醛中固定48 h，乙醇梯度脱水，利用二甲苯对组织进行透明处理，浸蜡包埋，切片机将组织切片（3～5m），苏木精伊红染色，二甲苯透明后经树胶封片，在光学显微镜下观察组织病理学变化。

1.8 ELISA检测肾脏中IL-1、IL-6、IL-10和TNF- 表达情况

颈椎脱臼处死小鼠，分离小鼠肾脏，PBS充分清洗后用滤纸充份吸干，取小鼠肾脏于PBS中匀浆，离心后，用ELISA试剂盒检测肺组织IL-1、TNF-、IL-6和IL-10含量，具体步骤按照试剂盒说明书进行。用酶标仪检测光密度（OD 570 nm）值，根据标准曲线计算浓度。

1.9 蛋白质印迹法检测肾脏中P65和I B 蛋白水平

取液氮保存的小鼠肾脏组织，充分研磨后转至离心管，加入RIPALysis Buffer（RIPA）及蛋白酶抑制剂（PMSF）混合（100:1）的细胞裂解液于冰上裂解。用BCA试剂盒测定蛋白浓度，取样本40g按比例与上样缓冲液混合，其他按文献步骤进行操作[12,13]，蛋白表达量以目的条带/-肌动蛋白（-actin）的灰度值表示。

1.10 统计学处理

用SPSS 20.0软件进行统计分析。采用单因素方差分析，Duncan多重检验进行分析。每个试验至少重复3次，数据以均值+标准差（SD）表示。

2 结果

2.1 各组小鼠体重及死亡率变化

与Control组比较，淫羊藿苷（CIA）组小鼠体重无显著差异，顺铂（CDDP）处理组小鼠体重显著下降（P＜0.01），CDDP+CIA处理组小鼠体重显著下降（P＜0.05）（图1 A）。且CDDP处理组分别在第3天、第7天、第9天及第11天出现小鼠死亡；CDDP+CIA处理组在第5天出现小鼠死亡（图1 B）。以上结果表明CDDP处理降低小鼠生长性能，CIA能缓解由CDDP诱导的小鼠生长性能下降。

图1 小鼠体重及死亡率Fig.1 The body weight and mortality of mice

2.2 各组小鼠肾脏指数变化

与Control组比较，CIA组与CDDP+CIA处理组小鼠肾脏指数无显著差异，CDDP组小鼠肾脏指数显著下降（P＜0.05）（图2 B）。且肾脏剖检结果表明，相比Control组与CIA组，CDDP处理组小鼠肾脏被膜表面出现凹凸不平、缺血等现象，而CDDP+CIA处理组小鼠肾脏无显著差异（图2 A）。以上结果表明CDDP处理诱导小鼠肾脏损伤，CIA能缓解由CDDP诱导的小鼠肾损伤。

图2 小鼠肾脏指数变化Fig.2 Changes of renal index in mice

2.3 各组小鼠血清中肌酐及尿素氮水平变化

与Control组相比较，CIA组小鼠血清中Scr、BUN水平无显著差异，CDDP组小鼠血清中Scr、BUN水平极显著上升（P＜0.01）。与CDDP组比较，CDDP+CIA组小鼠血清中Scr、BUN水平显著下降（P＜0.01）。以上结果表明CDDP处理降低小鼠肾功能，保护剂CIA缓解由CDDP诱导的小鼠肾功能损伤，见图3。

图3 小鼠血清中肌酐及尿素氮水平变化Fig.3 Changes of creatinine and urea nitrogen levels in serum of mice

2.4 各组小鼠肾组织病理变化

镜下观察小鼠肾组织病理变化，结果表明：Control组与CIA组小鼠肾小管形态完好，肾小管细胞整齐排列正常；CDDP组可观察到肾小管发生炎性病变，肾小管管腔内存在大量红细胞及炎性细胞浸润。CDDP+CIA组可观察到小鼠肾小管的炎性病变减轻，表现为肾小管形态回归正常，肾小管内红细胞及炎性细胞减少。以上结果表明CDDP处理诱导小鼠肾脏发生病变，CIA有效缓解由CDDP诱导的小鼠肾脏病变，见图4。

图4 小鼠肾组织病理变化Fig.4 Pathological changes of renal tissue in mice

2.5 各组小鼠肾脏中炎性因子变化

如图5所示，与Control组比较，CDDP组小鼠肾脏中炎性因子TNF-、IL-1和IL-6表达水平均显著上升（P＜0.01），抑炎因子IL-10表达水平显著下降（P＜0.01）。与CDDP组比较，CDDP+CIA组小鼠肾脏中炎性因子TNF-、IL-1和L-6表达水平显著下降（P＜0.05），抑炎因子IL-10表达水平显著上升（P＜0.05）。以上结果表明CDDP处理诱导小鼠炎症反应，CIA能缓解由CDDP诱导的小鼠炎症反应，见图5。

图5小鼠肾脏中炎性因子变化Fig.5 Changes of inflammatory factors in mouse kidney

2.6 各组小鼠肾脏中NF-B信号通路蛋白表达变化

如图6所示，与Control组比较，CDDP组小鼠肾脏中核因子蛋白P65的磷酸化水平显著升高，而P65蛋白的阻遏物I B蛋白的表达显著下降（P＜0.01）；与CDDP组比较，CDDP+CIA组小鼠肾脏中p-P65蛋白表达显著下降，I B蛋白的表达量显上升（P＜0.05）。以上结果表明CDDP处理激活小鼠体内NF-B信号通路，CIA能抑制由CDDP激活NF-B信号通路。

图6 小鼠肾脏中NF-B信号通路蛋白表达变化Fig.6 Changes of NF-B signaling pathway protein expression in mouse kidney

3 讨论

顺铂是一种临床上广泛应用的化疗抗肿瘤药物，由CDDP诱导的急性肾损伤限制了该类药物的使用，而由炎性粒细胞积累产生的炎症反应是CDDP产生急性肾损伤的主要诱因之一，因此抑制炎症通路、减轻肾脏炎性反应是治疗该病的关键[14]。淫羊藿苷是中草药淫羊藿的主要活性成分之一，具有抗炎，补肾壮阳作用[7,15]。本研究本研究通过建立CDDP诱导的小鼠急性肾损伤模型，探究ICA对急性肾损伤的保护作用。

结果表明，CDDP诱导小鼠产生严重的急性肾损伤，在CDDP处理组中，小鼠死亡率增加，体重下降，血清中Scr和BUN指标，炎性因子TNF-、IL-1和IL-6表达水平增加，NF-B信号通路被激活；而CIA处理能显著降低由CDDP诱导的小鼠肾损伤，以上结果提示ICA对CDDP诱导的小鼠急性肾损伤有一定的治疗作用，并且其可能是通过抑制小鼠体内NF-B信号通路以降低小鼠炎症反应来实现的。