山羊DNMT3B和KHDRBS2多态性及其与繁殖性能关联分析

李昆谕，刘玉芳，陶林，江炎庭，欧阳依娜，储明星※，洪琼花※

（1.云南省畜牧兽医科学院，云南 昆明 650224；2.河北工程大学生命科学与食品工程学院，河北 邯郸 056001；3.中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业农村部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193）

山羊（Capra hircus）作为人类最早驯养的动物之一，有着10 000多年的驯养历史，在人类农业文明和经济发展中起着重要的作用，为人类提供肉、奶、皮和毛等生活资料[1]。山羊繁殖性状是一个复杂的性状，受到多种因素的影响，且繁殖性状遗传力较低（0.1左右），是一种微效多基因控制的阈性状[2]。由于山羊世代间隔较长，运用传统育种手段很难达到快速提高产羔数的目的[3]。目前影响山羊多羔的主效基因尚未被发现，为了加快山羊育种工作的进程，寻找影响山羊产羔性状的主效基因势在必行。基因对山羊产羔性状的影响很大，主要表现在对母羊排卵数的影响上，而影响山羊产羔数的主要因素之一就是母羊的排卵数。不同基因对新陈代谢、生理途径和表型表达的影响是不同的，具有不同的协同或拮抗作用。因此，研究影响山羊产羔性状的候选基因并确定引起性状变异的原因是至关重要的。山羊育种改良的研究主要集中于繁殖性状的重要候选基因上，选择这些基因的有利等位基因可能有助于高产育种群体的建立，对山羊的选育工作有持续深远的影响。

DNA甲基转移酶3B（DNA methyltransferase 3 beta,DNMT3B）是一种编码哺乳动物胚胎发育过程中DNA甲基化所必需的从头甲基化酶，DNMT3B定位于山羊第13号染色体，CDS区由22个外显子组成，是DNMT家族中的一个重要成员[4]。有文献报道DNMT3B功能是特异性地参与重复DNA序列中CpG二核苷酸的甲基化[5]。DNMT3B存在于真核细胞染色体的中心卫星部分，虽然DNMT3B的主要功能是从头甲基化，但它也有维持甲基化的作用，DNMT3B也参与了卵母细胞的发育和卵子的排出等过程[5]。DNMT3B参与了动物生殖细胞的发育，在动物早期胚胎发育中也发挥着一定的作用[4,6,7]。

KHDRBS2定位于山羊第23号染色体上，拥有9个外显子。KHDRBS2属于KHDRBS家族中的一员，是一种RNA结合蛋白，KHDRBS家族属于一类信号转导及RNA激活超家族，此超家族成员与hnRNP K有同源结构域即KH结构域，均属于核糖蛋白并在进化上高度保守[8]。Salehian-Dehkordi H等[9]研究表明，KHDRBS2的拷贝数变异（CNV）与绵羊的产羔数显著相关。本研究的候选基因来自实验室前期基于重测序数据，通过GWAS分析（显著性阈值为0.05）所得在云上黑山羊（云上黑山羊是以云岭山羊为母本、努比山羊为父本培育而成的我国第一个肉用黑山羊品种[10,11]）全基因组中的正选择基因（positively selected genes,PSG）发现，DNMT3B和KHDRBS2共有6个SNPs位点，其中DNMT3B为g.61480806G＞A、g.61491787C＞T，KHDRBS2为g.47872502C＞T、g.48441325T＞C、g.48441364C＞T和g.48610246G＞C。我们采用了MassARRAY SNP分型技术，在云上黑山羊、济宁青山羊和辽宁绒山羊3个山羊群体中对候选基因的基因型进行检测，分析其多态性与产羔数性状之间的关联性，以期能够为山羊的高繁殖力性状选育工作提供更多参考。

1 材料与方法

1.1 实验样品

实验共采集768只山羊（2～5岁）的血液，其中云上黑山羊544只、济宁青山羊133只、辽宁绒山羊91只。本实验将济宁青山羊视为高繁殖力群体（平均产羔率283%），辽宁绒山羊视为低繁殖力群体（平均产羔率115%）[10,11]。所有试验用山羊饲养条件环境一致，云上黑山羊拥有至少1胎产羔数记录，部分拥有初生窝重和断奶窝重（3月龄）记录，所有羊均采用颈静脉采血（10 mL/只），使用EDTA-K2抗凝，-20℃保存。

1.2 血液DNA的提取

试验样本使用酚氯仿法提取基因组DNA，采用Nano Drop2000检测DNA样本浓度，1.2%琼脂糖凝胶电泳检测DNA质量。

表1 被测山羊品种及个体数量信息Table 1 Information on the breeds of goats tested and the number of individuals

1.3 基因分型

采用Sequenom MassARRAY SNP分型技术对DNMT3B和KHDRBS2基因SNPs位点进行检测，相关引物信息见表2，分型所用样品为先前提取的基因组DNA，每个样品需要量为20uL，DNA浓度为40～80 ng/uL。

表2 引物序列Table 2 Sequence of primer

1.4 统计分析

应用Excel软件统计山羊DNMT3B和KHDRBS2基因SNPs位点的基因型频率、等位基因频率、多态信息含量（PIC）、杂合度（He）和有效等位基因数（Ne），并进行Hardy-Weinberg平衡检验。采用IBMSPSS Statistics 25软件中的一般线性模型，多重比较采用LSD法，对云上黑山羊基因型与产羔表型数据进行关联分析，所有数据以平均值±标准误表示。

2 结果与分析

2.1 DNMT3B多态性分析

利用Sequenom MassARRAY SNP对768只山羊血液DNA进行基因分型。结果显示，DNMT3B g.61480806G＞A和g.61491787C＞T位点在云上黑山羊、济宁青山羊和辽宁绒山羊3个山羊群体中均存在多态性，其中g.61480806G＞A位点基因型为GG、GA、AA，g.61491787C＞T位点基因型为CT、TT（图1）。

图1 DNMT3B基因位点分型结果Fig.1 Results of DNMT3B gene locus typing

对济宁青山羊（高繁）和辽宁绒山羊（低繁）山羊品种中DNMT3B 2个SNPs位点的基因型频率和等位基因频率进行统计（见表3），其中，DNMT3B g.61491787C＞T位点的基因型频率和等位基因频率在高繁和低繁山羊群体间差异均达到显著水平（P＜0.05）；g.61491787C＞T位点在高繁群体和低繁群体的优势基因型为TT，优势等位基因为T。

表3 DNMT3B和KHDRBS2 6个多态位点在高繁、低繁山羊品种中的基因型和等位基因频率Table 3 Genotypes and allele frequencies of 6 polymorphic loci of DNMT3B and KHDRBS2 in high-and low-reproduction goats breeds

群体遗传学统计表明，DNMT3Bg.61480806G＞A位点在云上黑山羊中为中度多态（0.25＜PIC＜0.5），在济宁青山羊和辽宁绒山羊中为低度多态（PIC＜0.25）；DNMT3B g.61491787C＞T在云上黑山羊、济宁青山羊、辽宁绒山羊3个山羊群体中均为低度多态（PIC＜0.25）。卡方适合性检验结果表明，DNMT3B两个SNPs位点在云上黑山羊、济宁青山羊、辽宁绒山羊3个山羊群体中均处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05）（表4）。

2.2 KHDRBS2多态性分析

对KHDRBS2进行基因分型，结果显示KHDRBS2 4个候选位点（g.47872502C＞T、g.48441325T＞C、g.48441364C＞T和g.48610246G＞C）在3个山羊群体中均存在多态性（图2）。其中，KHDRBS2 g.48441325T＞C、g.48441364C＞T和g.48610246G＞C 3个位点在云上黑山羊、济宁青山羊、辽宁绒山羊3个山羊群体中存在3种基因型，g.47872502C＞T位点只在云上黑山羊中存在多态性（见表4）。

图2 KHDRBS2位点分型结果Fig.2 The results of KHDRBS2 locus typing

如表3所示，KHDRBS2 g.48441325T＞C和g.48441364C＞T位点的基因型频率和等位基因频率在高繁和低繁山羊群体间差异均达到显著水平（P＜0.05），但g.48610246G＞C位点的基因型频率和等位基因频率在高繁和低繁山羊群体间差异不显著（P＞0.05）。其中，g.48441325T＞C和g.48441364C＞T位点在高繁和低繁山羊群体中的优势基因型为CC，优势等位基因均为C；g.48610246G＞C位点在高繁和低繁山羊群体中的优势基因型为GG，优势等位基因均为G。

由表4可知，KHDRBS2 g.48441364C＞T位点在3个山羊群体中均为中度多态（0.25＜PIC＜0.5），KHDRBS2 g.47872502C＞T、g.48441325T＞C和g.48610246G＞C位点在3个山羊群体中为低度多态（PIC＜0.25）。卡方检验表明，KHDRBS2g.48610246G＞C位点在3个山羊群体中处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05）；g.47872502C＞T、g.48441325T＞C、g.48441364C＞T 3个位点在云上黑山羊中处于Hardy-Weinberg平衡状态（P＞0.05）。

表4 DNMT3B和KHDRBS2 6个多态位点在不同山羊品种中的群体遗传学分析Table 4 Population genetic analysis for 6 polymorphic loci of DNMT3B and KHDRBS2 in different goat breeds

2.3 候选SNPs位点与云上黑山羊繁殖性能的关联分析

DNMT3B g.61491787C＞T位点TC型个体的初生窝重和断奶窝重显著高于TT型个体（P＜0.05）；KHDRBS2 g.47872502C＞T位点CC型个体的产羔数显著高于CT型个体（P＜0.05），g.48441364C＞T位点CC型个体产羔数显著高于CT型和TT型个体（P＜0.05）。其余位点多态性与云上黑山羊产羔数、初生窝重和断奶窝重无显著相关（P＞0.05）（表5）。

表5 DNMT3B和KHDRBS2对云上黑山羊繁殖性能的影响（平均数±标准误）Table 5 The influence of DNMT3B and KHDRBS2 on the reproduction performance of Yun shang black goats(mean±standard error)

3 讨论

3.1 DNMT3B与生殖性状的关系

DNMT3B是哺乳动物发育所必需的一种甲基化酶，参与动物生理活动的多个方面，有研究表明DNMT3B的缺失会导致小鼠胚胎的死亡[12-14]。DNMT3B在哺乳动物的繁殖发育过程中发挥重要作用，卵母细胞的发育过程中需要DNMT3B进行甲基化调控，以保证卵子正常排出[15,16]。现阶段关于DNMT3B基因多态性与山羊繁殖关系的研究较少。本研究发现，DNMT3B g.61480806G＞A位点在云上黑山羊中为中度多态（0.25＜PIC＜0.5），说明这个群体有较大的遗传变异程度和较丰富的遗传多样性，该位点依然具有可观的选择潜能。DNMT3B g.61491787C＞T位点TC型初生窝重和断奶窝重显著高于TT型。DNMT3Bg.61491787C＞T位点或可作为云上黑山羊初生窝重和断奶窝重选择的一个潜在分子标记。

3.2 KHDRBS2基因与生殖性状的关系

KHDRBS2作为KHDRBS家族蛋白的一员，参与基因转录调控、细胞信号转导、mRNA选择性剪接等多种生物学进程，不仅如此，KHDRBS家族蛋白作为RBP在神经突触功能联系、精子发生、脂肪细胞分化调控等一些重要的过程中发挥一定的作用[17,18]。与其他RNA结合蛋白类似，KHDRBS家族蛋白在细胞信号通路中扮演着调节点的作用，细胞内外的信号调控各种激酶对KHDRBS家族蛋白的翻译后修饰以及KHDRBS家族蛋白与靶标RNA的结合，三者间的动态平衡对下游基因的表达有重要影响[19,20]。目前，关于KHDRBS2与山羊繁殖性状之间关系的研究报道较少。本研究发现，KHDRBS2 g.48441364C＞T位点在3个山羊群体中均为中度多态（0.25＜PIC＜0.5），说明该基因在多个群体中有较大的遗传变异程度和较丰富的遗传多样性。KHDRBS2 g.47872502C＞T位点CC型个体产羔数高于CT型个体0.278只，g.48441364 C＞T位点CC型个体产羔数分别高于CT型和TT型个体0.114只和0.12只。KHDRBS2 g.47872502 C＞T和g.48441364C＞T这两个突变导致了云上黑山羊产羔性状表型的变化，可见其对于云上黑山羊母羊的繁殖力是有一定的影响的。因此，KHDRBS2g.47872502C＞T和g.48441364C＞T两个位点或可作为云上黑山羊产羔数选择的潜在分子标记。

4 结论

综上所述，DNMT3Bg.61491787C＞T位点与云上黑山羊初生窝重和断奶窝重存在显著关联，可作为云上黑山羊窝重的选择。KHDRBS2 g.47872502C＞T和g.48441364C＞T位点与云上黑山羊产羔数存在显著关联，可作为云上黑山羊产羔数选择的潜在分子标记。