七叶皂苷钠对HepG2肝癌细胞氧化应激和体内成瘤的调控作用及其机制研究

刘东生，高成业，张宝书，翟菊敏，李广鑫

（邯郸市第一医院普外五科，河北 邯郸 056002）

原发性肝癌（HCC）是指发生于机体肝脏内的恶性肿瘤，是最常见的恶性肿瘤之一，据统计，全世界每年新发肝癌患者超过60万人，其发病率排恶性肿瘤的第5位，死亡率排第3，仅次于胃癌和食道癌[1,2]。临床上针对HCC的治疗，一般采用手术与放化疗相结合的方法。虽然目前针对HCC的多种手术和化疗等治疗手段在不断提高，但因为HCC具有侵袭性强、生长快和易转移等临床特性，临床HCC的治愈率及治疗效果仍然不佳[3]。并且，因为临床上治疗HCC的化疗药不多、选择面单一，长期单一化疗药物的临床使用往往导致患者耐药性的发生，从而使患者预后不佳。故而，继续开发新的HCC治疗药物和寻找新的HCC治疗靶点仍然是临床上HCC治疗亟待解决的问题。

近年来，中医中药在肿瘤疾病治疗方面的研究已经日趋广泛，相比于传统的化疗药物，中药及其提取物可以作用于肿瘤细胞生长的各个阶段，具有靶点多、副作用小及抗耐药性等诸多优点[4,5]。目前，已经有许多中药及其提取物在抗肝癌方面的研究[6]。研究表明蟾毒灵可通过干预不同信号途径抑制肝癌细胞增殖[7]；姜黄素衍生物C086和苦参碱可诱导肝癌细胞凋亡[8]；小檗碱可抑制肝癌细胞的侵袭和迁移等[9]。七叶皂苷是一种天然植物药，七叶皂苷钠（AS）是经七叶树科植物成熟种子提取得到的皂苷钠盐，具有抗炎、抗肿瘤作用[10]。之前的研究表明七叶皂苷钠可通过激活细胞内CARMA3/NF-B信号通路抑制肝癌细胞的增殖[11]。但是有关七叶皂苷钠的体内抗肝癌作用及其对肝癌细胞中氧化应激调控的作用机制仍然不清楚。

本研究以HepG2肝癌细胞为体外载体，Nude无胸腺裸鼠为体内载体，探究了七叶皂苷钠对HepG2肝癌细胞氧化应激和体内成瘤的调控作用，并进一步探究其中的潜在作用机制。

1 材料方法

1.1 材料

动物40只SPF级Nude无胸腺裸鼠（18.2±0.5）g购自浙江省实验动物中心，实验动物使用许可证编号：SYXK（浙）2021-0040。

试剂 七叶皂苷钠（E1378）、二甲基亚砜（D5879）（DMSO，纯度≥98%）购自美国Sigma公司。450 Y-P（HY-P0175）购自美国MCE公司。胎牛血清（10100147）和DMEM培养基（A4192101）购自美国Gibco公司；甲醇（AR，纯度≥99%）（M116115）、乙醇（AR，纯度≥99%）（E298791）和吐温20（Tween 20）（T274277）购自上海阿拉丁试剂有限公司。LDH试剂盒（A020-2-2）、活性氧（ROS）（E004-1-1）、丙二醛（MAD）（A003-1-2）、超氧化物歧化酶（SOD）（A001-3-2）及谷胱甘肽过氧化物酶（GSH）（A005-1-2）试剂盒购自南京建成生物工程研究所。

仪器CX23光学显微镜（日本奥林巴斯株式会社）；CO2培养箱（美国赛默飞公司）；生物安全柜（苏州云净公司）。

1.2 方法

1.2.1 动物试验 40只Nude无胸腺裸鼠被随机分为4组（n=10）：模型组（Model）、七叶皂苷钠低剂量组、七叶皂苷钠中剂量组及七叶皂苷钠高剂量组。将5 106个人肝癌细胞株HepG2消化、离心，溶于0.1 mL DMEM培养基中，皮下接种无胸腺裸鼠4周，建立肿瘤模型。随后，Model组腹腔注射生理盐水，低、中、高剂量七叶皂苷钠组分别腹腔注射1 mg/kg、2.5 mg/kg及5mg/kg的七叶皂苷钠。

1.2.2 细胞培养 人肝癌细胞HepG2株购自中国科学院典型培养物保藏委员会细胞库。细胞培养于37℃、5%CO2的恒温恒湿环境，孵育在10%胎牛血清、100 U/mL青霉素及100 U/mL链霉素的DMEM培养基中。

1.2.3 CCK8法检测七叶皂苷钠对人肝癌细胞HepG2的细胞活力影响 1 104个人肝癌细胞HepG2接种在96孔板中（n=6），共36孔，用不同浓度的七叶皂苷钠（0g/mL、10g/mL、20g/mL、30g/mL、40g/mL及50g/mL）处理HepG2细胞24 h，并在收样前1 h每孔加入10L的CCK8溶液，并继续于37℃孵育1 h，孵育结束后，震荡30 s，再用酶标仪在490 nm处测量每孔的吸光度，并计算细胞活力。

1.2.4 标准试剂盒检测七叶皂苷钠对HepG2细胞中LDH释放影响 为了检测HepG2细胞内乳酸脱氢酶（LDH）的释放，将1 104个细胞接种在96孔板中。用不同浓度的七叶皂苷钠（0g/mL、10g/mL、20g/mL、30g/mL、40g/mL及50g/mL）处理HepG2细胞24 h。孵育结束后将细胞培养基收集到试管中并在4℃、12 000 r/min离心15 min。收集上清液并储存在 20℃中。使用LDH标准试剂盒检测HepG2细胞中LDH的释放。

1.2.5 荧光定量PCR检测 对七叶皂苷钠对Nude无胸腺裸鼠肝脏及HepG2细胞中PI3K/Akt/mTOR基因表达影响1 105个HepG2细胞接种在12孔板中，使用0g/mL、10g/mL、20g/mL及30g/mL浓度梯度的七叶皂苷钠处理HepG2细胞24 h。随后用预冷的PBS洗涤处理细胞3次。细胞内总RNA使用RNAiso Plus试剂盒按照说明书提取。用1 000 ng总RNA进行反转录，得到第一链互补DNA（cDNA）。使用ABI Prism Step One Plus检测系统进行实时聚合酶链式反应PCR，检测Nude无胸腺裸鼠肝脏及HepG2细胞中PI3K、Akt和mTOR基因的表达量。引物由南京擎科生物公司合成，见表1。

表1 人源引物序列Table 1 primer sequences of homo

表2 鼠源引物序列Table 2 primer sequences of mouse

1.2.6 统计学分析 数据作图以均值±均值标准误（x±s）形式表现，使用SPSS（22.0版本）软件进行数据分析，使用GraphPad Prism 8.0软件进行图片制作。使用单因素方差分析进行组间比较，*P＜0.05，#P＜0.05表示差异显著，**P＜0.01，##P＜0.01表示差异极显著，每组实验重复最少3次。

2 结果

2.1 七叶皂苷钠对Nude无胸腺裸鼠体内成瘤的影响

七叶皂苷是一种天然植物药，七叶皂苷钠（AS）是由七叶树科植物种子提取得到的皂苷钠盐。为探究七叶皂苷钠对Nude无胸腺裸鼠体内成瘤的影响，通过对Nude无胸腺裸鼠皮下接种人肝癌细胞HepG2建立Nude无胸腺裸鼠皮下肿瘤模型；通过腹腔注射1 mg/kg、2.5 mg/kg及5 mg/kg的七叶皂苷钠探究七叶皂苷钠对Nude无胸腺裸鼠体内成瘤的影响。结果如表1所示，与模型组相比，七叶皂苷钠处理组显著降低Nude无胸腺裸鼠体内瘤重及增加Nude无胸腺裸鼠体重（P＜0.05），且2.5 mg/kg的七叶皂苷钠治疗组有最好的治疗效果。以上结果表明，七叶皂苷钠对Nude无胸腺裸鼠体内成瘤有显著抑制作用。

表3 不同浓度的七叶皂苷钠对Nude无胸腺裸鼠体内成瘤的影响（n=10）Table 3 Effects of different concentrations of AS on tumorigenesis in mice(n=10)

2.2 七叶皂苷钠对Nude无胸腺裸鼠肝脏内PI3K/AKT/mTOR通路基因表达的影响

PI3K/Akt/mTOR信号通路是机体在生长、代谢过程中发挥重要功能的信号转导机制，在机体的各个生命活动中都发挥重要作用，尤其是在肿瘤信号的传导过程中。为探究七叶皂苷钠对Nude无胸腺裸鼠肝脏内PI3K/AKT/mTOR通路基因表达的影响，我们在处死Nude无胸腺裸鼠后，分离小鼠的肝脏并提取肝脏中的总RNA，通过荧光定量PCR法探究七叶皂苷钠对Nude无胸腺裸鼠肝脏内PI3K/AKT/mTOR通路基因表达的影响。结果见图1，七叶皂苷钠显著降低了Nude无胸腺裸鼠肝脏内PI3K/AKT/mTOR通路基因的表达（P＜0.05）。且2.5 mg/kg的七叶皂苷钠给药组与5 mg/kg的七叶皂苷钠给药组有相似的基因表达，进一步证明了2.5 mg/kg的七叶皂苷钠可能是治疗Nude无胸腺裸鼠皮下肿瘤的最佳药物浓度。

图1 不同浓度的七叶皂苷钠对Nude无胸腺裸鼠肝脏内PI3K/AKT/mTOR信号通路基因表达的影响Fig.1 Effects of different concentration of AS on gene expression of PI3K/AKT/mTOR signaling pathway in mice

2.3 七叶皂苷钠对人肝癌细胞HepG2细胞活力的影响

为探究七叶皂苷钠对人肝癌细胞HepG2细胞活力的影响，用0g/mL、10g/mL、20g/mL、30g/mL、40g/mL及50g/mL浓度的七叶皂苷钠处理HepG2细胞24 h，随后用CCK8法测定细胞活力。结果如图2所示，七叶皂苷钠对HepG2细胞的细胞活力的影响呈浓度依赖性，20～50g/mL的七叶皂苷钠处理显著降低了HepG2细胞的细胞活力（图2A），增加HepG2细胞中乳酸脱氢酶（LDH）释放（图2B）。应用SPSS软件计算得七叶皂苷钠对HepG2细胞的半数抑制率（IC50）为29.08g/mL。以上述结果表明，七叶皂苷钠对人肝癌细胞HepG2的细胞活力均有明显抑制作用（P＜0.05），且呈浓度依赖性。依据CCK8及LDH试验的浓度筛选，0g/mL、10g/mL、20g/mL及30g/mL浓度的七叶皂苷钠被用于后续实验。

图2 不同浓度七叶皂苷钠对人肝癌细胞HepG2细胞活力的影响Fig.2 Effects of different concentration AS on the cell viability of HepG2 cells

2.4 七叶皂苷钠对人肝癌细胞HepG2氧化损伤的影响

氧化损伤是指机体内活性氧（ROS）和活性氮（RNS）产生过多，机体无法及时清除而引起机体中蛋白质产生损伤的现象。依据CCK8及LDH对七叶皂苷钠药物的浓度筛选的试验结果，0g/mL、10g/mL、20g/mL及30g/mL浓度的七叶皂苷钠被用于测试七叶皂苷钠对人肝癌细胞HepG2氧化损伤的影响，结果表明七叶皂苷钠显著诱导人肝癌细胞HepG2产生氧化损伤，表现为HepG2细胞中谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-px）水平及超氧化物歧化酶（SOD）水平显著下降，而HepG2细胞内活性氧（ROS）水平及丙二醛（MAD）水平显著上升P＜0.05，且呈浓度依赖性。以上结果表明七叶皂苷钠诱导人肝癌细胞HepG2产生氧化损伤。

图3 不同浓度的七叶皂苷钠对人肝癌细胞HepG2中氧化损伤的影响Fig.3 Effect of oxidative damage of different concentration AS on HepG2 cells

2.5 七叶皂苷钠对人肝癌细胞HepG2中PI3K/AKT/mTOR通路基因表达的影响

为七叶皂苷钠对HepG2细胞中PI3K/AKT/mTOR通路基因表达的影响，通过抽取HepG2细胞中的总RNA，并用荧光定量PCR的方法检测了七叶皂苷钠处理下，HepG2细胞内PI3K/Akt/mTOR信号通路表达的表达量。结果如图4所示，相比Control组，七叶皂苷钠处理组呈浓度依赖性的下调HepG2细胞内PI3K、Akt及mTOR基因的表达量（P＜0.05）。综上所述，以上结果表明七叶皂苷钠处理抑制人肝癌细胞HepG2内PI3K/Akt/mTOR信号通路表达。

图4 不同浓度的七叶皂苷钠对人肝癌细胞HepG2中PI3K/AKT/mTOR通路基因表达的影响（n=5）Fig.4 Effects of AS on the gene expression ofPI3K/AKT/mTOR signal pathway in HepG2 cells(n=5)

2.6 740Y-P对HepG2细胞中PI3K/AKT/mTOR通路基因表达的影响

740 Y-P是PI3K/Akt/mTOR信号通路的一种特异性小分子激活剂。740 Y-P被用来探究PI3K/Akt/m TOR信号通路在七叶皂苷钠诱导人肝癌细胞HepG2氧化损伤及凋亡中的具体作用。结果如图5所示，与Control组相比，20g/mL的七叶皂苷钠处理显著降低人肝癌细胞HepG2内PI3K/Akt/mTOR信号通路基因的表达（P＜0.05），表现为HepG2细胞内PI3K、Akt及mTOR基因的表达量显著下降；与20g/mL的七叶皂苷钠组相比，740Y-P+七叶皂苷钠处理组能显著上调PI3K/Akt/mTOR信号通路基因的表达（P＜0.05）。以上结果表明，740Y-P处理重新激活了HepG2细胞中PI3K/Akt/mTOR信号通路。

图5 激活剂740 Y-P对人肝癌细胞HepG2中PI3K/AKT/mTOR通路基因表达的影响（n=5）Fig.5 Effects of 740 Y-P on the gene expression of PI3K/AKT/mTOR signal pathway in HepG2 cells(n=5)

2.7 PI3K/AKT/mTOR通路在七叶皂苷钠诱导HepG2细胞氧化损伤中的作用

进一步，我们测试了利用740 Y-P重新激活PI3K/Akt/mTOR信号通路时，HepG2细胞内氧化因子表达的情况。结果如图6所示，与Control组相比，20g/mL的七叶皂苷钠处理显著上调HepG2细胞内ROS水平及MAD表达水平（P＜0.05），下调细胞内SOD水平及GSH-px表达水平。而在使用740Y-P激活剂重新激活HepG2细胞中的PI3K/Akt/mTOR信号通路后，HepG2细胞内ROS水平及MAD的表达水平显著降低（P＜0.05），且细胞内SOD及GSH-px的表达水平表现了相同的作用趋势。综上所述，以上结果表明，激活细胞内的PI3K/Akt/mTOR信号通路降低七叶皂苷钠诱导的HepG2细胞氧化损伤。

图6 激活剂740 Y-P对HepG2细胞中氧化损伤的影响Fig.6 Effects of 740 Y-P on the oxidative damage in HepG2 cells

3 讨论

HCC是发生在消化系统中的最常见的恶性肿瘤之一，HCC的病因复杂，具有侵袭性强、生长快、易转移等临床特性[1]。因为HCC的化疗药选择面窄，且长期单一化疗药物的临床使用往往导致患者耐药性的发生，致使患者HCC的治愈率及治疗效果不佳。本研究以HepG2肝癌细胞为体外研究载体，Nude无胸腺裸鼠为体内研究载体，探究了七叶皂苷钠对HepG2肝癌细胞氧化应激和体内成瘤的调控作用，并进一步探究了PI3K/Akt/mTOR信号通路在其中的具体作用。

Nude无胸腺裸鼠是查尔斯河实验室在1985年通过BALB/cABom-nu和BALB/cAnNCrj-nu进行杂交和回交从而获得的，因为其天生的免疫缺陷，故而常被用于建立肿瘤模型[12]。我们的研究结果表明，将5 106个人肝癌细胞株HepG2接种在Nude无胸腺裸鼠皮下4周后，小鼠显著成瘤，而在经过1 mg/kg、2.5 mg/kg及5 mg/kg的七叶皂苷钠治疗后，小鼠肿瘤重量显著降低，并且2.5 mg/kg的七叶皂苷钠抗肿瘤效果最佳，从体内验证了七叶皂苷钠的体外抗肿瘤效果。肝癌细胞HepG2来源于一名15岁的高加索白人男性肝癌标本，于1979年由knowles等[13]人建立，是肝癌体外研究中常用的细胞模型。我们的结果表明七叶皂苷钠对人肝癌细胞HepG2的细胞活力有明显抑制作用，且呈浓度依赖性（图2），并且七叶皂苷钠还呈浓度依赖性地诱导HepG2细胞的氧化损伤，进一步验证了七叶皂苷钠的体外抗肿瘤效果。

PI3K/Akt/mTOR信号通路是细胞内重要的信号转导分子，在细胞的增殖、代谢过程中发挥重要作用，并且其在肿瘤信号的转导过程中同样发挥重要作用[14]。之前的研究表明有多种中药的抗肿瘤靶点是与机体PI3K/Akt/mTOR信号通路的调控相关的，如华良姜素能通过影响细胞内PI3K/Akt信号通路基因表达抑制HepG2细胞的增殖，桦木酸通过调节PI3K/Akt/mTOR信号通路诱导人结肠癌细胞SW620凋亡[15,16]。HepG2细胞中PI3K/AKT/mTOR通路相关的基因未发生突变，所以可用于研究PI3K/AKT/mTOR通路与肝细胞癌之间的密切关系。结果表明七叶皂苷钠下调了Nude无胸腺裸鼠肝脏及HepG2细胞中PI3K/Akt/mTOR基因的表达。而在使用PI3K/AKT/mTOR通路的特异性激活剂后，七叶皂苷钠诱导HepG2细胞的氧化损伤作用被抑制，PI3K/AKT/mTOR通路在七叶皂苷钠对HepG2肝癌细胞氧化应激和体内成瘤的调控作用中起关键作用，并且可能是原发性肝癌的中药靶点之一。

综上所述，七叶皂苷钠能诱导HepG2肝癌细胞的氧化损伤，并且抑制由HepG2细胞接种的体内成瘤，其可能是通过调控机体内的PI3K/AKT/mTOR通路来实现的。结果表明七叶皂苷钠对原发性肝癌有抑制作用，其有潜力成为一种协同辅助治疗药物来应用于原发性肝癌的治疗。