基于特征图谱及一测多评法同时测定重楼药材中9 种甾体皂苷的方法研究

白玉莹，高 岩，贾天颖，王京昆，苏 钛，徐新房，王 璇，程水清，文 佳，李向日*

（1.中药炮制研究中心/中药品质评价北京重点实验室，北京 102488；2.北京同仁堂药材参茸投资集团有限公司，北京 100035；3.北京同仁堂股份有限公司同仁堂制药厂，北京 102629；4.云南省药物研究所，昆明 650111）

重楼为百合科植物云南重楼Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis (Franch.) Hand.-Mazz.或七叶一枝花Paris polyphyllaSmith var.chinensis (Franch.) Hara的干燥根茎。秋季采挖，除去须根，洗净，晒干[1]。重楼药用历史悠久，始载于《神农本草经》，用于惊痈、摇头弄舌、热气在腹中、癫痈、痈疮、阴蚀、下三虫、去蛇毒[2]。重楼应用历史广泛，距今已有两千多年的历史。

本实验采集基原确定的重楼原药材，野外采集云南重楼正品10 批，七叶一枝花正品7 批，对其建立特征图谱和9 种指标性成分等内在指标性成分含量测定方法，对其质量进行评价。重楼饮片只需经过净制、切制的炮制加工即得，所以该方法对重楼药材和饮片都适用，尤其是重楼饮片，切制后无法辨别真伪。本研究对重楼药材及饮片真伪的确定、安全有效使用及质量标准的完善提供数据支持。

1 仪器与试剂

1.1 仪器 Waters 1525 高效液相色谱仪（Waters 1525系统，Waters 2487 紫外检测器，Breeze 色谱工作站，美国 Waters 公司）、色谱柱（Agilent SB-C18，250 mm×4.6 mm，5 μm）、十万分之一电子天平（德国赛多利斯仪器系统公司）、Sartorius 电子分析天平（上海嘉鹏科技有限公司，精度为0.000 1）。

1.2 试剂与试药 乙腈为色谱纯；水为娃哈哈纯净水；乙醇和甲醇均为分析纯。

采集基原确定的重楼原药材，野外采集10 批正品云南重楼（Paris polyphyllaSmith var.yunnanensis（Franch.）Hand.-Mazz.），7 批正品七叶一枝花（Paris polyphyllaSmith var.chinensis（Franch.）Hara），经中国科学院昆明植物研究所李恒研究员鉴定基原，现标本藏于云南省药物研究所。其中编号1～10 为云南重楼，编号11～17 为七叶一枝花。

2 重楼特征图谱方法的建立

2.1 特征图谱相关条件的优化 建立重楼饮片的特征图谱，为此本实验通过对特征图谱的检测波长选择、梯度洗脱条件、供试品提取方法、提取溶剂、提取次数等相关条件进行筛选和优化，其相关条件稳定可控，可实现在测定重楼饮片特征图谱的要求。

2.1.1 检测波长的筛选 重楼内80 %以上的成分为皂苷类成分，由于皂苷类成分属于末端吸收，为保证特征图谱基线的平稳，出峰数，各色谱峰的分离情况。优化筛选203 nm 和210 nm 中更适合特征图谱采集的检测波长。在203 nm 和210 nm 条件下，基线平稳、各个峰分离度情况基本一致，因203 nm 条件下吸收值较高，故选择检测波长为203 nm。

2.1.2 梯度洗脱条件的优化 重楼提取物化学成分种类较多，且不同成分之间极性差别较大，如果等度进行分离，不能达到预期分离效果，因此选择进行梯度洗脱条件。优化标准为色谱峰数分离度高、基线平稳及分析时间尽可能缩短，经过反复试验得到了较理想的梯度洗脱条件。检测波长为203 nm，流速为 1.1 mL/min，进样量10 μL，以乙腈为流动相 A，0.1%磷酸水溶液为流动相B，洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱分离条件 %

2.1.3 特征图谱 9 种成分峰的指认 特征图谱建立过程中，以相关对照品的出峰时间为标准，共指认了可同时具备定量和定性条件的9 个指标性成分，9个指标性成分的分离度均大于1.5，其对称因子均在0.95～1.05之间。因此本方法指认此9种成分为目标峰，见图1，图2。

图1 样品3 特征图谱

图2 标准品图

2.1.4 提取方法的筛选 本实验以9 种指标性成分的峰面积总和为评判对比标准，对比超声提取和回流提取2 种方法。提取流程为取重楼粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密移入95%乙醇25 mL，称定重量，加热回流或超声提取30 min，放冷，再称定重量，用95%乙醇补齐重量，滤过，置100 mL 旋蒸瓶中，40℃旋干，残渣加甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶中，以甲醇为溶剂，稀释至刻度，摇匀，即得。按照梯度洗脱条件进样10 μL，测得各指标成分色谱峰的峰面积，通过总峰面积对比发现超声比回流提取效率更高，所以本实验选择超声提取。

2.1.5 提取溶剂的筛选 本实验以9 种指标性成分的峰面积总和为评判对比标准，优选对比甲醇和95%乙醇2 种提取溶剂中，对重楼饮片提取效率高的提取溶剂。其提取流程为取重楼粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密移入甲醇或95%乙醇25 mL，称定重量，超声提取30 min，放冷，再称定重量，用相应的溶剂补齐重量，滤过，置100 mL 旋蒸瓶中，40℃旋干，残渣加甲醇溶解并转移至10 mL容量瓶中，以甲醇为溶剂，稀释定容至刻度，摇匀，滤过，即得。按照梯度洗脱条件进样10 μL，测得各指标成分色谱峰的峰面积，通过总峰面积对比发现甲醇提取样品的总峰面积高于乙醇，所以本实验选择甲醇作为提取溶剂。

2.1.6 提取次数的筛选 本实验以不同提取次数 9 种指标性成分的相应峰面积总和，占多次提取的总峰面积的比例。筛选出最佳的提取次数。

通过实验数据可知，第一次提取样品9 种指标性成分的峰面积占3 次总峰面积的86.64 %，第二次提取样品9 种指标性成分的峰面积占3 次总峰面积的11.32%。第三次提取9 个指标性成分峰面积之和占3次总峰面积的2.04 %，小于总峰面积的3.0%，第二次提取已经提取样品完全，因此本方法的提取次数为2次。

综上，供试样品提取方法为取重楼粉末（过三号筛）0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称重，超声提取（功率500 W，频率 40 kHz）2次，每次30 min，放冷，再称重，加甲醇补齐重量，滤过，合并溶液置100 mL 旋蒸瓶中，40 ℃旋干，残渣加甲醇使溶解，转移至10 mL容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得。

2.2 特征图谱方法学考察

2.2.1 稳定性 以同一编号的供试样品，制备样品溶液，分别于制样后 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、10 h、12 h和 24 h 分别进样，按照梯度洗脱条件进样 10 μL，测得各指标成分色谱峰的峰面积，样品中9 种特征图谱指认峰峰面积 RSD 值在 0.71%～1.54 %之间，表明供试品溶液在制备后24 h 内稳定。

2.2.2 精密度 以同一编号的供试样品，制备样品溶液，连续进样6 针，按照梯度洗脱条件进样 10 μL，测得各指标成分色谱峰的峰面积，结果表明样品中9 种特征图谱指认峰峰面积RSD值在0.33%～1.48 %之间，表明仪器精密度良好。

2.2.3 重复性 以同一编号的供试样品，制备6 份样品溶液，按照梯度洗脱条件进样 10 μL，测得各指标成分色谱峰的峰面积，结果表明样品中9 种特征图谱指认峰含量测定值RSD 值在2.10%～3.00%之间，表明该方法的重复性良好。

2.3 重楼市售饮片特征图谱采集

2.3.1 供试样品制备 取重楼粉末（过三号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，超声提取30 min，过滤，重复以上流程2 次，合并溶液置100 mL 旋蒸瓶中，40 ℃旋干，甲醇溶解，定容至10 mL 容量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，即得。

2.3.2 特征图谱采集 分别精密吸取供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。见图3。

图3 正品重楼特征图谱采集数据

通过基原确定的重楼原药材的特征图谱采集情况可知，正品重楼饮片的内在成分种类和含量差别不大，相似度较好。通过其特征图谱可以反映饮片内在质量。

3 同时测定重楼9 种甾体皂苷成分含量测定方法的研究

在特征图谱建立过程中，以相关对照品的出峰时间为标准9 种甾体皂苷的分离度均＞1.5，其对称因子在0.95～1.05 之间，满足定性定量要求。因此重楼9种指标性成分含量测定采用特征图谱的液相色谱条件。供试品溶液制备条件同特征图谱。

3.1 重楼饮片9 种指标性成分含量测定方法学考察

3.1.1 标准曲线考察 取对照品适量，配置成重楼皂苷 I、重楼皂苷 II、重楼皂苷Ⅲ、重楼皂苷Ⅳ、重楼皂苷V、重楼皂苷VI、重楼皂苷VII、重楼皂苷 H、重楼皂苷 D 的对照品储备液，使其浓度分别为2.104、1.984、2.172、3.084、0.353 6、1.988、2.112、0.37、1.64 mg/mL，取混合对照品溶液 0.00、0.625、1.250、2.500、3.750 mL 于5 mL 容量瓶中甲醇定容至刻度，按上述梯度洗脱条件，分别精密吸取供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。以9 种甾体皂苷的进样浓度（mg/mL）为横坐标（X），响应峰面积（AU·min）为纵坐标（Y），绘制标准曲线，计算回归方程。如表2 所示。

表2 标准曲线考察

3.1.2 稳定性考察 同“2.2.1”特征图谱项下稳定性考察。

3.1.3 精密度考察 同“2.2.2”特征图谱项下精密度考察。

3.1.4 重复性考察 同“2.2.3”特征图谱项下重复性考察。

3.1.5 加样回收率性考察 取已知含量的同一编号的供试样品，精密称取 0.25 g，精密加入等量的对照品，按照供试品溶液的制备项下供试品溶液制备方法平行制备6 份样品溶液，测定9 个指标性成分的含量，计算加样回收率，加样回收率均在 95%～105%之间。符合定量分析要求。

3.2 重楼饮片9 种指标性成分含量测定

3.2.1 供试样品制备方法 同“2.3.1”特征图谱项下供试样品制备。

3.2.2 对照品溶液的制备 取重楼皂苷I、重楼皂苷II、重楼皂苷Ⅲ、重楼皂苷Ⅳ、重楼皂苷V、重楼皂苷VI、重楼皂苷VII、重楼皂苷 H、重楼皂苷 D对照品适量，精密称定，取各对照品储备液适量加甲醇配制呈上述9 种成分分别为 0.42、0.40、0.43、0.41、0.07、0.40、0.42、0.07、0.08 mg/mL 的混合溶液，即得。

3.2.3 梯度洗脱条件 同“2.1.2”特征图谱项下梯度洗脱条件

3.2.4 含量测定 分别精密吸取供试品溶液和对照品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定，即得。按外标一点法计算9 种的指标性成分的含量，见表3。

表3 9 种指标性成分含量测定（n =4） %

由以上含量测定数据可知，云南重楼所含皂苷多为薯蓣皂苷，七叶一枝花所含皂苷多为偏诺皂苷。含量测定结果表明，样品1～10 中均未检测出重楼皂苷Ⅵ，样品11～17 中部分可检测出重楼皂苷Ⅵ，但检出量也较低。课题组前期研究发现，延龄草中重楼皂苷Ⅵ含量较高，而延龄草为重楼常见混淆品。因此，当市售重楼饮片中含有较高重楼皂苷Ⅵ时，提示可能掺入延龄草等伪品药材[3]。

4 小结

文献研究表明，重楼中含有甾体皂苷、黄酮苷、植物蜕皮激素、多糖、脂肪酸酯、肌酸酐、鞣质、苯丙素类、单宁酸生物碱、氨基酸及微量元素等成分[4-9]。现代药理学研究表明，重楼甾体皂苷具有抗肿瘤、抗炎抑菌、镇静止痛、止咳平喘、抗氧化、调节免疫、抗肺部纤维化等作用[10-16]。

重楼于《中国药典》1977 年版开始收录，于2005年版加入含量测定，限度为按干燥品计算，含重楼皂苷Ⅰ和重楼皂苷Ⅱ的总量，不得少于0.80%，后于2010 年版进行修订，更改为按干燥品计算，含重楼皂苷Ⅰ，重楼皂苷Ⅱ，重楼皂苷Ⅵ和重楼皂苷Ⅶ的总量不得少于0.60%。研究表明，重楼皂苷Ⅵ的含量对重楼药材是否符合限度标准并未造成影响，且当重楼药材中含有较高重楼皂苷Ⅵ时，更应考虑重楼伪品延龄草的掺入等情况。目前，重楼皂苷Ⅵ对照品（20 mg）市场价格为1 000～3 000 元，考虑到成本及以上原因，建议中国药典重楼药材标准去掉重楼皂苷Ⅵ，保留重楼皂苷Ⅰ、Ⅱ、Ⅶ，但限度不变，仍为“总量不得少于0.60%”。目前，以上意见均已被《中国药典》2020 版采纳收录。

近年来，重楼野生资源枯竭，因其种植培育周期长、存在风险等因素，重楼药材及饮片的价格急剧增长，市场上掺仿现象频发。因此，有必要建立多种成分同时测定的特征图谱和含量测定方法，对重楼药材和饮片的质量进行有效质量控制。为评价重楼市售饮片质量现状，本实验对基原确定的17 批正品重楼药材的内在指标性成分进行了考察。为完善重楼内在指标性成分的相关方法，本文建立了重楼的特征图谱和9 种指标性成分同时进行含量测定的方法，所建立的方法操作简便、结果准确稳定，可用于重楼内在指标性成分含量的检测，同时也为重楼饮片的质量评价及《中国药典》重楼标准的修订提供了理论依据。