胰高血糖素样肽-1受体rs3765467基因多态性与冠心病的相关性研究

宋瑞，钱航，李东锋，陈继舜，闵新文，杨汉东，陈俊，许浩

(1.锦州医科大学国药东风总医院研究生培养基地；2.湖北医药学院附属国药东风总医院心内科，湖北 十堰 442008)

冠状动脉粥样硬化性心脏病(coronary heart disease，CHD)是全球致残和死亡的主要原因之一[1]。动脉粥样硬化是CHD的主要病理机制，是一种以脂肪堆积、平滑肌细胞增殖、细胞凋亡、坏死、纤维化和局部炎症为特征的慢性炎症性疾病[2]。动脉粥样硬化发生及发展是一种多因素的复杂过程，与吸烟、饮酒等生活方式有关，也与高血脂、高血糖、遗传等因素密切相关。既往研究表明,糖脂代谢紊乱在动脉粥样硬化发生发展过程中起到了重要的作用[3]。

胰高血糖素样肽-1受体(GLP-1R)G蛋白偶联受体B家族，主要分布胰腺、肺、心脏、肾脏、血管平滑肌、脂肪细胞、胃肠道及中枢神经系统等[4]。研究表明，胰高血糖素样肽-1受体激动剂(GLP-1RA)促使GLP-1R与胰高血糖素样肽-1(GLP-1)结合，使其半衰期延长，发挥活性GLP-1作用，主要通过减少炎性细胞、抑制炎性因子的释放和改善氧化应激，降低内皮细胞的损伤，改善内皮细胞功能，从而影响动脉粥样硬化的发生发展；并通过抑制巨噬细胞的浸润、钙沉积、细胞外基质重构及血管平滑肌细胞增殖，可以限制斑块进一步增厚和破裂[5]。目前GLP-1R基因多态性作为糖尿病治疗的重要靶点的研究较为广泛，但关于其与冠心病发病风险及影响血脂水平方面的研究报道较少。本研究分析了GLP-1R基因rs3765467基因多态性与冠心病患病风险的关系，进一步对冠心病的早期识别以及相关基因靶点药物治疗提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 资料对象

收集2020年7月至2021年5月，在湖北医药学院附属国药东风总医院心内科，住院已经行选择性冠脉造影检查的病人的临床资料及血液样本，共280例，以冠脉造影检查发现冠状动脉主支狭窄程度≥50%为诊断冠心病的标准；以冠状动脉造影未见明显冠状动脉狭窄为对照组的标准。根据造影结果分为对照组(n=148例)及病例组(CAD，n=132例)。

排除标准：(1)既往心肌梗死；(2)急性心衰；(3)白血病；(4)多发性骨髓瘤；(5)贫血；(6)甲状腺疾病；(7)感染性疾病；(8)急慢性肝肾功能不全及其他影响肾功能疾病；(9)免疫性疾病；(10)肿瘤。

本研究经湖北医药学院附属国药东风总医院医学伦理委员会批准，每例病人均在在入组前知晓检测目的并签署知情同意书。

1.2 标本的收集与保存

禁食12～14 h后，次日清晨采肘静脉血2管，各5 mL。其中1管使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管，用来提取基因组DNA；另1管为促凝管，分离血清后用于生化指标检测，生化指标包括：总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)、载脂蛋白a(ApoA1)、载脂蛋白(ApoB)。

1.3 基因多态性的检测

按照 TIANGEN 试剂盒说明方法提取外周血DNA，运用超微量紫外分光光度计测定其DNA的浓度和纯度，浓度大于20 ng/μL，并记录DNA原液浓度并对应编号，放置于-80 ℃冰箱待测。在NCBI数据库下载rs3765467位点500 bp左右的基因序列，引物设计软件Pimer 5.0设计下列引物：GLP-1R-rs3765467位点引物序列如下：上游引物5′-GCAGGGATAGCCCTCAGAAT-3′；下游引物5′-TGTTCCAAGGCCAGAGGT-3′，引物由生工Sangon Biotech公司进行合成。取2 μL提取DNA样品最终配成25 μL反应体系(GLP-1R基因、Primer 1、Primer 2、2×PCR mix、ddH2O)置于PCR仪中，PCR程序设定为：预变性94 ℃ 3 min；变性94 ℃ 30 s，退火50 ℃～65 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 1 min，循环30次；终延伸72 ℃ 5 min；反应结束后取5 μL反应产物进行琼脂糖凝胶电泳；经琼脂糖鉴定无误后，将扩增产物送至生工Sangon Biotech公司进行测序，随后进行测序结果分析。

1.4 观察指标

(1)比较两组一般资料、BMI、高血压病史及血脂水平；(2)两组 GLP-1R rs3765467 位点基因分型及各基因频率分布；(3)比较病例组GLP-1R rs3765467基因多态性与血脂水平之间关系；(4)通过Logistic回归分析，分析基因多态性与CHD患病发生的关系。

1.5 统计学方法

2 结 果

2.1 两组患者一般资料及生化指标比较

与对照组相比，病例组中年龄、性别比例、吸烟比史、BMI、TC、LDL-C、ApoA1、既往高血压病史差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 一般资料及生化指标比较

2.2 两组研究对象GLP-1R rs3765467基因分型及各基因频率分布

经SNPscanTM分型技术对rs3765467位点进行基因型鉴定，该位点有3种基因型，分别为TT、CT、CC。GLP-1R rs3765467基因位点在对照组与病例组中基因频率分布均符合哈迪温伯格(H-W)平衡，可代表整体，进行遗传分析。见表2，rs3765467在对照组与病例组基因型与等位基因频率分布比较差异无统计学意义(P>0.05)。

表2 基因型及等位基因频率分布[n(%)]

2.3 病例组GLP-1R rs3765467基因多态性与血脂水平关系

对病例组人群进行GLP-1R rs3765467位点多态性与血脂水平之间的分析。GLP-1R rs3765467位点时，对照组TT+TC基因型TG水平明显高于携带CC基因型人群，差异有统计学意义(P<0.05)。其中女性携带TT+TC基因型比携带CC基因型具有更高TG(P<0.05)，见表3。

表3 病例组rs3765467基因多态性与血脂水平关系

2.4 Logistic回归分析

排除传统冠心病发病危险因素(年龄、性别、吸烟史、BMI、高血压、血脂、2型糖尿病)，通过Logistic回归分析，rs3765467位点中 TT基因型是冠心病的发病的独立危险因素，携带 TT基因型患CAD风险是CT/CC基因型携带者的 4.681倍(OR=4.681，95%CI：1.017～21.534，P=0.047)，差异有统计学意义(P<0.05)。携带TT基因型患冠心病风险是CT基因型携带者的4.79倍(OR=4.790，95%CI：1.017～22.573，P=0.048)，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

表4 Logistic回归分析结果

3 讨 论

人类GLP-1R基因由13个外显子和12个内含子组成，位于6号染色体p21.1带，其长度为38.9 kb。GLP-1R与GLP-1结合，激活后可以通过升高细胞内环磷酸腺苷水平、细胞内钙离子含量，导致葡萄糖依赖性胰岛素释放，从而起到降糖作用[6]。同时作用于下丘脑，通过降低食欲、增加饱腹感、增强肝脏脂肪酸氧化以及延缓胃排空等作用，降低体脂水平[7]。既往研究表示，GLP-1R 基因多态性与空腹血糖、BMI、胰岛功能、营养摄入等有关，在不同人群中 GLP-1R 基因不同位点的突变可引起酪氨酸磷酸化障碍，导致胰岛素分泌量改变，从而影响血糖水平[8]。本研究分析 GLP-1R 基因 rs3765467 位点多态性分布特征，上述数据表明，GLP-1R 基因 rs3765467 位点存在多态性，但在对照组与病例组中等位基因与基因型分布无显著性差异。在病例组GLP-1R 基因rs3765467位点突变型血脂TG水平明显高于纯合子携带人群，与李蕊等[9]研究发现一致，rs3765467位点突变型的TG水平明显高于纯合子，但其研究等位基因与基因型分布存在明显差异，考虑可能由于样本量不足、种群及纳入人群有关。

在心血管系统方面，GLP-1受体激动剂可以通过降低餐后血脂、降糖、抑制心肌氧化应激和抗炎、改善血管内皮、控制血压及体重减轻，对心血管起到间接或直接保护作用[10]。在动脉粥样硬化形成过程中，GLP-1受体激动剂还可通过抑制斑块进展、改变斑块组成成分及维持斑块稳定[11]。高脂血症是冠心病发病主要危险因素[12]。B.Vergès等[13]研究显示，GLP-1受体激动剂可以降低TC、载脂蛋白B-48和载脂蛋白C-Ⅲ。既往研究中表明，使用两种不同GLP-1受体激动剂后可观察到两种药物均可以降低餐后血脂[14]。GLP-1R受体激动剂通过调节胰岛素抵抗，影响血脂水平，平衡糖脂代谢关系，起到抑制冠心病发生。本研究表明，携带 TT基因型患CAD风险是CT/CC基因型携带者的 4.681倍，表明GLP-1R基因rs3765467位点多态性与冠心病发病风险相关，为冠心病基因遗传学方面研究，提供新思路。

目前发现与 GLP-1R 功能改变有关的 SNPs 主要位点：rs6923761、rs3765467、rs4714210、rs103 05492、rs367543060、rs742764、rs10305420和rs 2254336。de Luis DA等[15]在肥胖人群一项研究中发现，GLP-1R rs6923761 与G等位基因携带者相比，A等位基因携带者其体质指数、脂肪量、腰围、TG和HDL-c水平明显减低。 2型糖尿病患者中 GLP-1R rs3765467位点突变型患者对DPP-4抑制剂的应答比例更高，糖化血红蛋白下降幅度也更大[16]。在对日本普通人群的横断面研究[17]中，rs3765467多态性人群在营养摄入后，消耗营养过程中有较好的促胰岛素作用，可诱导胰岛素分泌增加>100%。在GLP-1R SNPs的研究中发现[18]，rs3765467和rs10305492 基因位点对β细胞的胰岛素分泌能力和β细胞质量有重要的调节作用，可能通过使β细胞的功能障碍和凋亡而影响GLP-1与GLP-1R的相互作用,从而进一步降糖。提示 GLP-1R 基因 rs3765467 位点多态性可能影响血糖水平。

现在关于GLP-1R rs3765467基因多态性方面研究还包括了神经系统疾病。Qiu[19]在中国汉族人群研究中得出，GLP-1R rs3765467基因多态性是帕金森病的潜在危险因素，尤其是男性和晚发帕金森病患者。在低体重儿预喂养GLP-1，其水平升高可能损害下丘脑和外周GLP-1R信号，对下丘脑核调节能量稳态产生长期的负面影响，增加肥胖和糖尿病的风险[20]。

根据以上研究可知，GLP-1R 基因rs3765467位点具有基因多态性，且多态性可能引起血糖、血脂、胰岛素分泌的改变。目前研究推测GLP-1R基因的异常表达由于基因突变可能导致，从而增加冠心病的患病风险。影响主要集中在调节糖脂代谢紊乱、改善炎症反应等方面，本次研究样本量较少，基因位点单一，可通过扩大样本标本进一步研究GLP-1R多个基因多态性与高脂血症、2型糖尿病患病风险之间的关系。