复合酶提取豆粕多糖的工艺研究

魏雅婷，张进，潘静，李照杰，杨红澎，通信作者

复合酶提取豆粕多糖的工艺研究

魏雅婷1,2，张进3，潘静4，李照杰1，杨红澎1，通信作者

（1. 天津农学院 农学与资源环境学院，天津 300392；2. 天津师范大学 生命科学学院，天津 300387；3. 农业农村部乳品质量监督检验测试中心，天津 300381；4. 赤峰海关综合技术服务中心，内蒙古 赤峰 024055）

通过单因素试验考察了果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶和中性蛋白酶对豆粕中可溶性大豆多糖提取效果的影响，并考察了两两组合及3种酶组合之后酶的最佳用量。结果表明：1.5%果胶酶和4.5%纤维素酶提取大豆多糖的得率最高，0.5%木瓜蛋白酶和3.0%中性蛋白酶去除蛋白的效果最好；将果胶酶分别与木瓜蛋白酶、中性蛋白酶以1.5∶0.5和1.5∶3.0的比例混合，纤维素酶分别与木瓜蛋白酶、中性蛋白酶以4.5∶0.5和4.5∶3.0的比例混合，得出两两组合酶中果胶酶与木瓜蛋白酶、中性蛋白酶在3.5%和1.0%用量下效果较佳；将纤维素酶与这两种组合酶分别以4.5∶3.5和 4.5∶1.0比例混合，得到纤维素酶与果胶酶和中性蛋白酶3种复合酶为最佳组合，用量为5.0%，多糖得率为24.21%，蛋白残留2.29%。此研究结果可为后续复合酶提取豆粕多糖的工艺研究提供了一定的理论依据。

豆粕多糖；复合酶提取法；最佳用量；工艺研究

自2008年起，我国每年生产和消费的大豆高达几千万吨，2017年突破1.7亿t，但随之产生的大量豆渣并没有被有效利用[1]。早在20年前，美国、日本等一些发达国家开始重点研究豆渣的开发及合理利用[2]。豆渣中含有大量的蛋白质、维生素、膳食纤维和多糖等营养成分，以及人体所必需的8种氨基酸、大豆异黄酮、各种维生素和矿物质，其中膳食纤维含量高达55%，粗蛋白质含量为18%～23%[3]。闵翔宇等[4]研究发现，豆渣中的膳食纤维可以调节人体血糖平衡，增加饱腹感，预防肥胖和便秘，提高机体免疫力。更重要的是，大豆中的可溶性大豆多糖不仅可以作为膳食纤维的补充剂，抑制油脂氧化，在酸性乳饮料中起稳定作用，而且还可作为可降解膜用于食品保鲜及包装[5]。

以往相关研究大都采用水提法提取大豆多糖。桂雨豪等[6]认为，利用水提法提取大豆多糖的最佳工艺为：料液比1∶20，温度110 ℃，pH4.5，提取时间3 h，在此条件下多糖得率为52.4%，纯度为69.88%，但该工艺并未考虑蛋白残留问题。在酸提法提取大豆多糖方面，于培玲[7]采用磷酸水溶液提取法提取多糖的最佳工艺条件为：料液比 1∶11，温度140 ℃，pH 3.5～4.0，提取时间4 h，在此条件下提取率为5.42%。何喜珍等[8]利用超声波辅助过氧化氢法提取多糖，并对比单独使用超声波法、过氧化氢法以及二者搭配使用的优缺点，认为二者搭配使用要优于单独使用。在酶解法提取大豆多糖方面，范文奇等[9]认为纤维素酶提取多糖最佳提取工艺为：料液比1∶20，温度60 ℃，pH 5.0，酶用量1.0%，酶解时间90 min，此条件下多糖得率为14.92%。田瑞红等[10]采用超声波辅助纤维素酶提取多糖，提出最佳提取工艺条件为：料液比1∶28，温度55 ℃，pH 5.0，酶用量0.6%，酶解时间1.5 h，超声150 W，88 ℃，17 min，此条件下多糖提取率为25.92%。

传统水提法虽然成本低廉，材料易得，但提取温度较高，容易造成能源上的浪费。酸提法不仅没有降低能耗比，而且多数酸性溶液都有腐蚀性，对环境造成危害。酶提法不仅工艺条件较温和，无毒无害，能耗比低，而且多糖提取率及多糖蛋白残留也高于其他方法。检索相关文献发现，有关复合酶提取大豆多糖的提取工艺研究尚未见报道。本研究以豆粕为提取材料，将去除蛋白酶和提取多糖酶进行复合，探讨复合酶提取大豆多糖的最佳用量，为豆粕再利用工业提取大豆多糖提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

大豆浸提豆油之后的豆粕（在某电商平台上购买得到）。葡萄糖、苯酚、硫酸、牛血清白蛋白、蒸馏水、无水乙醇、磷酸、果胶酶、纤维素酶、木瓜蛋白酶、中性蛋白酶、氢氧化钠、盐酸。以上化学药剂均为分析纯。

1.2 仪器与设备

粉碎机，上海夏丰实业有限公司；紫外分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；电子分析天平、pH计、真实泵，河南巩义仪器有限公司；恒温磁力搅拌器、离心机，合肥科晶材料技术有限公司；旋转蒸发器，日本东京理化有限公司；电子万用炉，江苏科析仪器有限公司；真空干燥箱，郑州长城科工贸技术有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 豆粕预处理

将买来的豆粕过两遍筛网，用粉碎机研磨成粉至不再有明显的颗粒状，置于恒温烘箱中烘干，装入自封袋备用。称取150 g豆粕，按料液比1∶5的比例，用无水乙醇在75 ℃ 下冷凝回流1 h，离心取沉淀备用。

1.3.2 绘制标准曲线

1.3.2.1 葡萄糖标准曲线的制作

称取0.1 g葡萄糖，量取100 mL蒸馏水，将二者放入150 mL烧杯中混合均匀，于1 000 mL容量瓶中定容，配成0.1 mg/mL葡萄糖标准液，备用。

称取6 g苯酚，加蒸馏水定容至100 mL容量瓶中，配成6%苯酚溶液，备用。

采用硫酸-苯酚法测定多糖含量，温度室温，显色时间20 min[11]。分别取葡萄糖标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4和1.6 mL加入比色管，加蒸馏水定容至2 mL，随后加入1 mL 6%苯酚溶液和5 mL硫酸进行混合，摇匀至混合溶液颜色均一，呈橙黄色，室温下放置20 min，在490 nm下用紫外分光光度计测量吸光度，测得葡萄糖标准曲线，＝0.005 2＋0.013 4（2＝0.997 6）[2]。

1.3.2.2 蛋白质标准曲线的制作

将100 mg考马斯亮蓝溶于50 mL 95%乙醇中，加100 mL 85%磷酸混合均匀，加蒸馏水定容至1 000 mL，过滤掉不溶性杂质和部分色素，配成考马斯亮蓝显色剂，避光保存，备用，保质期为1个月。

将10 mg牛血清白蛋白溶于蒸馏水，定容至100 mL容量瓶中，配成100 μg/mL牛血清白蛋白标准溶液。

分别取蛋白质标准溶液0.0、0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mL加入比色管，加蒸馏水定容至1.0 mL，并加入5 mL考马斯亮蓝，摇匀至混合溶液颜色均一，室温放置5 min，在595 nm下测得吸光度[12]，得蛋白质标准曲线，＝0.008 2＋0.038 4（2＝0.993 2）。

1.3.3 4种单一酶的最佳用量测定

1.3.3.1 提取多糖酶的最佳用量

称取5 g处理后的豆粕，按照料液比1∶30的比例，加入150 mL pH 5.5的蒸馏水，在50 ℃条件下恒温酶解反应1 h，分别考察果胶酶和纤维素酶的最佳用量。两种酶用量见表1，作3组平行试验，取平均值[13-14]。

表1 果胶酶和纤维素酶用量表 %

酶种类酶用量 果胶酶0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0 纤维素酶0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0

1.3.3.2 去除蛋白酶的最佳用量

称取5 g处理后的豆粕，按照料液比1∶30的比例，加入150 mL pH 5.5的蒸馏水，在50 ℃条件下恒温酶解反应1 h，分别考察中性蛋白酶和木瓜蛋白酶的最佳用量，以及考察二者在不同水平用量时多糖提取液中蛋白残留量。两种酶用量见表2，作3组平行试验，取平均值[15-16]。

表2 中性蛋白酶和木瓜蛋白酶用量表 %

酶种类酶用量 中性蛋白酶0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0 木瓜蛋白酶0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0

1.3.4 两种酶混合后的最佳用量

得到单一酶最佳用量之后，按照单一酶用量比例进行两两混合，测定方法与1.3.3相同。取5 g处理好的豆粕，按照料液比1∶30的比例，加入150 mL pH 5.5的蒸馏水，50 ℃恒温酶解1 h，分别考察混合酶用量以及样品中的多糖含量和蛋白质含量。混合酶用量见表3，作3组平行试验，取平均值。

表3 两种酶复配后混合酶用量表 %

酶种类酶用量 纤维素酶＋中性蛋白酶0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0 纤维素酶＋木瓜蛋白酶0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0 果胶酶＋木瓜蛋白酶0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0 果胶酶＋中性蛋白酶0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0

1.3.5 3种酶复合后的最佳用量

考察纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶的组合以及纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶的组合，通过单因素结果、两两组合最佳结果确定3种酶用量比例。取5 g处理好的豆粕，按照料液比1∶30的比例，加入150 mL pH 5.5的蒸馏水，50 ℃恒温酶解反应1 h，分别考察混合酶用量以及多糖提取率和蛋白残留量。混合酶用量见表4，作3组平行试验，取平均值。

表4 3种酶复配后混合酶用量表 %

酶种类酶用量 纤果木酶0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0 纤果中酶0.51.01.52.02.53.03.54.04.55.0

注：纤果木酶即纤维素酶、果胶酶、木瓜蛋白酶的组合；纤果中酶即纤维素酶、果胶酶、中性蛋白酶的组合

2 结果与分析

2.1 4种单一酶的用量分析

2.1.1 提取多糖酶的用量分析

10个不同用量的样品经果胶酶和纤维素酶提取后离心，将所得上清液进行多糖提取率的测定，结果如图1所示。由图1可知，果胶酶和纤维素酶的最佳用量分别为1.5％和4.5％，此时果胶酶酶解多糖得率为46.0%，纤维素酶酶解多糖得率为54.2%。

图1 单一酶提取多糖结果对比图

2.1.2 去除蛋白酶的用量分析

分别将经木瓜蛋白酶和中性蛋白酶处理的10个豆粕样品离心，取上清液进行蛋白含量测定，结果如图2所示。由图2可知，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶的最佳用量分别为0.5%和3.0%，此条件下木瓜蛋白酶酶解后多糖提取液中蛋白残留量为2.88%，中性蛋白酶酶解后多糖提取液中蛋白残留量为4.05%。

图2 单一酶除蛋白结果对比图

2.2 两种酶复配后混合酶的用量分析

酶解提取多糖的酶和去除蛋白的酶按最佳用量进行两两组合，酶解样品，离心，取上清液进行多糖和蛋白含量的测定，结果如图3～图4所示。从蛋白残留量可以看出，果胶酶和木瓜蛋白酶组合（1.5∶0.5）及果胶酶和中性蛋白酶组合（1.5∶3.0）效果较佳，多糖提取率为分别为27.50%和15.50%，蛋白残留量分别为5.77%和2.29%，复合酶用量分别为3.5%和1.0%。

图3 两种酶复配后混合酶提取多糖结果对比图

图4 两种酶复配后混合酶除蛋白结果对比图

2.3 3种酶复配后混合酶的用量分析

根据上述试验结果，将纤维素酶分别与果胶酶和木瓜蛋白酶组合（1.5∶0.5）以及果胶酶和中性蛋白酶组合（1.5∶3.0）以4.5∶3.5和4.5∶1.0比例混合，发现除蛋白效果最好且大豆多糖得率较高的为纤维素酶＋果胶酶＋中性蛋白酶组合，多糖得率为24.21%，蛋白残留量为2.29%，复合酶用量为5.0%，如图5～图6所示。纤维素酶＋果胶酶＋木瓜蛋白酶组合用量为5.0%时，多糖得率最高，为31.94%，同时蛋白残留也很高，达到8.88%，在用量为0.5%和4.0%时，多糖得率分别为13.77%和29.40%，蛋白残留量为6.10%和6.46%，也较高。因此，确定纤维素酶与果胶酶和中性蛋白酶组合（1.5∶3.0）混合比例为4.5∶1.0组合是最优组合。

图6 3种酶复配后混合酶除蛋白结果对比图

3 讨论与结论

本试验把去除蛋白酶与提取多糖酶进行复合，并对复合酶进行了最佳酶用量测定，由试验结果可知，采用复合酶工艺的多糖得率为24.21%，高于文献[9]中报道的14.92%，与超声波辅助酶提法[10]相差1.71%。但在工业实际应用中，超声波方法较难普及，常规罐式酶解便于厂家在设备低投入下进行生产。

本试验获得了酶提法的最佳提取条件。单一酶的酶解条件为：料液比1∶30，1 h，pH 5.5，50 ℃，在此条件下最佳提取多糖酶用量分别为果胶酶1.5%，纤维素酶4.5%，最佳去除蛋白酶用量分别为木瓜蛋白酶0.5%，中性蛋白酶3%。两两组合中果胶酶与木瓜蛋白酶和中性蛋白酶在3.5%和1.0%的用量下效果较佳，果胶酶与木瓜蛋白酶用量比例为1.5∶0.5，果胶酶与中性蛋白酶比例为1.5∶3.0。3种复合酶组合中纤维素酶与果胶酶和中性蛋白酶为最佳组合，用量为5.0%，多糖得率为24.21%，蛋白残留2.29%，其中纤维素酶与果胶酶和中性蛋白酶复合酶（1.5∶3.0）比例为4.5∶1.0。

本试验中3种酶的混合比例判断标准是以去除蛋白的效果为主因素，希望后续研究可以进一步对比多糖提取率、探讨豆粕除淀粉工艺、明确淀粉酶和提取多糖酶及去除蛋白酶之间影响关系。

[1] 张振山，叶素萍，李泉，等. 豆渣的处理与加工利 用[J]. 食品科学，2004，25（10）：400-406.

[2] 何玉红. 豆渣中水溶性大豆多糖的提取及其在面包中的应用[D]. 合肥：合肥工业大学，2007.

[3] 高金燕. 豆渣的营养与药用价值[J]. 中国食物与营养，2003（11）：49-50.

[4] 闵翔宇，马梓涵，罗昇宇，等. 豆渣的利用现状及应用研究进展[J]. 动物营养，2019（5）：17-19.

[5] 韩晴，李军国，蔡云霞，等. 不同来源水溶性大豆多糖功能特性及基本结构的比较研究[J]. 食品安全质量检测学报，2020，11（9）：188-195.

[6] 桂雨豪，郭蔼明，杨锦杰，等. 从豆渣中提取水溶性大豆多糖的工艺优化研究[J]. 中国酿造，2015，34（9）：71-74.

[7] 于培玲. 水溶性大豆多糖的提取、纯化及其结构性质的测定研究[D]. 广州：华南理工大学，2018.

[8] 何喜珍，牛延宁，金明飞，等. 不同分子量大豆多糖的表征和抗氧化研究[J]. 大豆科学，2016，35（5）：805-809.

[9] 范文奇，要志宏，申丽媛，等. 豆粕多糖的酶法提取工艺研究[J]. 中国调味品，2017，42（5）：65-68，83.

[10] 田瑞红，江连洲，胡少新，等. 超声波酶法提取豆渣中水溶性多糖条件的优化[J]. 食品工业科技，2011，32（11）：305-308.

[11] 崔旭兰，陈锦桃，何杜朋，等. 不同提取方法对银杏叶多糖含量的影响[J]. 广州中医药大学学报，2019，36（1）：115-118.

[12] 司华静，齐军茹，杨晓泉，等. 可溶性大豆多糖的提取及对蛋白的稳定作用[J]. 食品工业科技，2007，28（10）：116-117.

[13] 韩伟，马婉婉，骆开荣. 酶法提取技术及其应用进 展[J]. 机电信息，2010（17）：15-18.

[14] 余炳锋，黎锦碧，李忠芳，等. 木瓜蛋白酶水解大豆豆渣的工艺优化研究[J]. 轻工科技，2018，34（11）：21-23.

[15] 张庆增. 复合酶法提取当归多糖及其生物活性研究[D].长春：吉林大学，2006.

[16] 羿庆燕，崔福顺，华晶忠，等. 纤维素酶法提取大豆多糖的工艺研究[J]. 延边大学农学学报，2010，32（2）：119-124.

Study on extraction technology of soybean meal polysaccharide by compound enzyme

Wei Yating1,2, Zhang Jin3, Pan Jing4, Li Zhaojie1, Yang Hongpeng1, Corresponding Author

（1. College of Agronomy and Resource Environment, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2. College of Life Sciences, Tianjin Normal University, Tianjin 300387, China; 3. Dairy Product Quality Supervision, Inspection and Testing Center of Ministry of Agriculture and Rural Affairs, Tianjin 300381, China; 4. Chifeng Customs Comprehensive Technical Service Center, Chifeng 024055, Inner Mongolia Autonomous Region, China）

In this study, the effects of pectinase, cellulase, papain and neutral protease on the extraction of soluble soybean polysaccharide from bean curd were investigated by single factor method, and then the optimal amount of enzyme was investigated after the combination of two enzymes and three enzymes. The results showed that 1.5% pectinase and 4.5% cellulase had the best effect on soybean polysaccharide extraction, and 0.5% papain and 3.0% neutral protease had the best effect on protein removal. The ratio of pectinase and papain was 1.5∶0.5, and the ratio of pectinase and neutral protease was 1.5∶3.0. The mixture of cellulase and papain was 4.5∶0.5, and that of cellulase and neutral protease was 4.5∶3.0. The results showed that the effect of pectinase and papain was better at the dosage of 3.5%, and that of pectinase and neutral protease was 1.0%. The cellulase was mixed with the above composite enzyme at the ratio of 4.5∶3.5 and 4.5∶1.0, respectively. The results showed that complex enzyme of cellulase, pectinase and neutral protease was the best, the dosage was 5.0%, the polysaccharide yield was 24.21%, and the protein residue was 2.29%. The optimal amount of complex enzyme will provide a theoretical basis for the subsequent extraction of soybean meal polysaccharide by complex enzyme.

soybean meal polysaccharide; compound enzyme extraction; optimal dosage; process research

1008-5394（2022）02-0027-05

10.19640/j.cnki.jtau.2022.02.006

TS214.2；TQ281

A

2020-10-16

天津市蔬菜产业技术体系创新团队资助项目（ITTVRS2017015）；天津市科技计划项目（20ZYCGSN00390）; 天津农学院大学生创新创业训练计划项目（201810061219）

魏雅婷（1997—），女，硕士在读，研究方向：肿瘤细胞周期分子调控机制。E-mail：weiyating_971203@126.com。

杨红澎（1974—），男，副教授，博士，研究方向：植物及食用菌次生代谢产物的分离鉴定研究。E-mail：yanghongpeng2003@163.com。

责任编辑：宗淑萍