海南红树林内生真菌Aspergillus sp. HNY16-5C的含氮类次级代谢产物*

肖泽恩，林少娥，佘志刚，陆勇军，谭振，刘永宏

1. 广西中医药大学海洋药物研究院/药学院，广西 南宁 530200

2. 广西壮瑶药工程技术研究中心，广西 南宁 530200

3. 中山大学化学学院，广东 广州 510275

4. 中山大学生命科学学院，广东 广州 510275

肺结核是由结核分枝杆菌引起的传染性疾病，世界卫生组织发布的《2020 年全球结核病报告》［1］显示，2019 年全球累计约有1 000 万人患上结核病，死亡人数约120万。近年来，泛耐药结核以及与HIV 相关的结核病使其临床治疗更加困难和复杂，迫使人们寻找新的化学治疗方法［2］。由结核分枝杆菌分泌的酪氨酸磷酸酶B（MptpB 酶）是结核分枝杆菌的重要毒力因子，是造成肺结核的关键酶。因此，以MptpB 酶为靶点，快速筛查具有潜在抗结核活性的化合物吸引了越来越多科学家的关注［3］。

本课题组对来源于海南东寨港红树林自然保护区红树无瓣海桑的内生真菌Aspergillussp.HNY16-5C进行规模发酵，对其代谢产物进行了分离纯化和结构鉴定，获得了6 个化合物，分别为brevianamide K（1）、brevianamide V（2）、（R）-brevianamide Q（3）、（R）-brevianamide R（4）、（±）-asperginulin A（5）和brevianamide M（6）（图1）；利用MptpB酶抑制活性模型，对化合物1～6进行了活性测试，首次发现化合物1 显示有较强的MptpB 酶抑制活性，是潜在的抗结核活性化合物。

图1 化合物1～6的结构Fig.1 The structure of compounds 1-6

1 实验部分

1.1 仪器与试剂

EYELA 旋转蒸发仪N-1300S（日本东京理化器械株式会社）；MLS-3781L-PC 高压蒸汽灭菌器（日本Panasonic 公司）；Polaptronic HNQW5 型旋光仪（德国Schmidt-Haensch 公司）；J-810 圆二色光谱仪（日本JASCO 公司）；Bruker Avance 400 核磁仪（瑞士Bruker 公司）；Thermo Finnigan LCQDECA质谱仪（美国Thermo公司）；Oxford Gemini S Ultra 晶体衍射仪（英国牛津衍射公司）；LC1620高效液相色谱仪（上海舜宇恒平科学仪器有限公司）；SW-CJ-2F洁净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；ZWYR-2102立式恒温培养振荡器（上海智城分析仪器制造有限公司）；AL104 万分之一电子天平（瑞士梅特勒公司）；HH-S4 数显恒温水浴锅（常州金坛良友仪器有限公司）；WFH-203B 暗箱式紫外线分析仪（杭州齐威仪器有限公司）；YMC ODS-A 色谱柱（日本YMC公司）；正相薄层层析板GF254 和柱层析硅胶（青岛海洋化工厂）；核磁测试用氘代试剂（美国Sigma-Aldrich 公司）；液相用甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

1.2 菌株来源

内生真菌Aspergillussp. HNY16-5C 由中山大学生命科学学院陆勇军教授课题组提供，采集自海南东寨港红树林自然保护区，从红树植物无瓣海桑的叶子中分离纯化。通过用真菌ITS间隔序列的碱基序列在GenBank 做对比相似性分析，鉴定菌株HNY16-5C 为曲霉属真菌Aspergillussp.。DNA序列已提交至GenBank（序号JX993829）。该菌种已提交中国菌种保藏中心保存（保藏号CCTCC M 2012358）。

1.3 发酵条件

种子培养基（PDB）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、海盐3 g、水1 000 mL；发酵培养基：江西琼丰仙桃米50 g，w=3‰海盐水50 mL。将纯化的菌种接到装有200 mL 土豆培养液的锥形瓶（500 mL）中，在25 ℃摇床培养3～5 d，获得种子培养液；取2 mL 种子培养液加到装有大米培养基的锥形瓶（1 000 mL）中，接种100瓶，25 ℃静置培养28 d。

1.4 提取与分离

用3 倍体积甲醇浸泡菌体3～4 次，每次24 h，减压浓缩得粗提液，用等体积乙酸乙酯萃取3 次，合并有机相，减压浓缩获得粗浸膏（80.05 g），通过正相硅胶柱层析（200～300 目），以石油醚-乙酸乙酯为流动性进行梯度洗脱［V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）= 1∶9～ 0∶10］，获得8 个组分（Fr.1～ 8）。其中Fr.4经正相柱层析［V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=1∶9～ 0∶10］和Sephadex LH-20［V（氯仿）∶V（甲醇）=1∶1］纯化得到化合物1（20 mg）和2（17 mg）；Fr.5经反相柱层析［V（甲醇）∶V（水）=1∶9～9∶1］、凝胶Sephadex LH-20（甲醇）以及半制备HPLC［V（甲醇）∶V（水）=6∶4］纯化得到化合物5（7 mg，tR12 min）；Fr.6 经正相柱层析［V（石油醚）∶V（乙酸乙酯）=1∶9～ 0∶10］、凝胶Sephadex LH-20（甲醇）和反相柱层析［V（甲醇）∶V（水）=2∶8～9∶1］纯化得到化合物3（11 mg）、4（8 mg）和6（15 mg）。

1.5 MptpB酶抑制活性测试

中山大学陆勇军教授课题组以结核菌H37Rv株基因组DNA 为模板，利用PCR 克隆MptpB 酶基因，并成功在Escherichia coliBL21 中得到高效表达，获得有活性的重组MptpB酶，建立了以MptpB酶为靶点的抗肺结核活性测试模型［4］。在此模型基础上， 我们对从内生真菌Aspergillussp.HNY16-5C 中分离获得的6 个含氮类化合物进行了MptpB酶抑制活性测试。

2 结果与讨论

2.1 结构鉴定

化合物1：黄色针状晶体，EI-MSm/z347［M］+，推测其结构中含有N 原子，结合核磁数据推测分子式为C21H22N3O2，不饱和度为13。核磁数据 如 下：1H NMR（CDCl3，400 MHz）δ：10.99（1H，s，18-NH），8.80（1H，s，2-NH），7.39（1H，d，J=7.9 Hz，H-13），7.17（1H，d，J=7.5 Hz，H-16），7.06（1H，t，J= 7.2 Hz，H-15），6.99（1H，t，J= 6.8 Hz，H-14），6.50（1H，s，H-10），6.09（1H，d，J= 2.9 Hz，H-8），6.00（1H，dd，J=14.2，8.8 Hz，H-21），5.05（1H，d，J=8.8 Hz，H-22a），5.00（1H，d，J= 14.2 Hz，H-22b），4.00（2H，t，J= 8.9 Hz，H-6），2.79（2H，dt，J= 8.9，2.9 Hz，H-7），1.44（3H，s，H-23），1.43（3H. s，H-24）；13C NMR（CDCl3，101 MHz）δ：155.0，154.0， 145.0， 144.6， 135.6， 134.0， 126.4，126.1， 121.3， 119.4， 119.2， 112.1， 112.0，110.3，103.1，46.0，39.5，28.1，27.9。与文献［5］数据比对，化合物1鉴定为brevianamide K。

图2 化合物4的单晶结构图Fig.2 The single crystal structure of compound 4

2.2 MptpB酶抑制活性测试结果

MptpB 酶抑制活性测试结果显示，化合物1 具有较强的酶抑制活性，IC50为（7.07±2.76）μmol/L（见图3），其他化合物无明显酶抑制活性（IC50>100 μmol/L）。

图3 化合物1的MptpB酶抑制活性Fig.3 The MptpB inhibitory activities of compound 1

3 结 语

本文从海南东寨港红树植物无瓣海桑的内生真菌Aspergillussp. HNY16-5C中分离得到6个含氮类化合物，分别是brevianamide K（1）、brevianamide V（2）、（R）-brevianamide Q（3）、（R）-brevianamide R（4）、（±）-asperginulin A（5）和brevianamide M（6），其中，化合物1～5 为二酮哌嗪类化合物。首次发现化合物1具有MptpB酶抑制活性，具有开发为抗结核分枝杆菌药物的巨大潜力。