额日木中绿原酸和橙皮素的含量测定

陈敖日格拉，辛 颖，其乐木格，王青虎

（内蒙古民族大学 蒙医药学院，内蒙古 通辽 028043）

大籽蒿（Artemisia sieversiana Ehrhart ex Willd.）蒙药名额日木，菊科，蒿属一、二年生草本植物，分布于我国多个省份，多生于路旁、荒地、河漫滩、草原、干山坡或林缘等，局部地区成片生长。《中华本草》记载本品味苦、微甘，性凉，具有清热利湿、凉血止血等功效，主治肺热咳嗽、咽喉肿痛、湿热黄疸等病，也是藏医上常用的药材之一。高海拔地区额日木用来治愈紫外线照射引发的灼伤［1］。据文献报道［2-8］，额日木主要化学成分有木脂素、肌醇类、萜类、黄酮类及苷类等。额日木具有抗癌［2］、抗菌及抗氧化作用［9］。目前，关于额日木定性定量分析方面尚未见研究报道，笔者拟将以洋艾素和橙皮素为检测指标，运用高效液相色谱法（High performance liquid chromatography，HPLC）创建额日木中2个化学成分的检测方法，为额日木的定量分析提供了有力依据。

1 仪器和材料

LC-20A 型高效液相色谱仪：日本岛津；KQ-600DB 型超声波冲洗器：昆山市超声仪器有限公司；AUW220D 型电子天平：日本岛津。绿原酸和橙皮素均为自制，对绿原酸和橙皮素HPLC 分析，纯度＞98.0 %，符合对照品使用要求。色谱甲醇和乙腈：Fisher Scientific Inc，United States；超纯水为自制。额日木采集于内蒙古境内不同地域，经药用植物学红艳副教授鉴定为正品，药材来源见表1。

表1 额日木采集信息Tab. 1 Collecting information of Artemisia sieversiana

2 方法与结果

2．1 溶液配制

2.1.1 供试液配制

额日木粉末各1.0 g，精密称定，放置于50 mL锥形瓶中，用甲醇20 mL超声处理30 min，滤过，滤液上加入活性炭1.0 g，放置2 h，滤过，即得供试液。

2.1.2 绿原酸和橙皮素储备液配制

绿原酸和橙皮素对照品各10 mg，加甲醇溶解，并配制成1.00 mg·mL-1的洋艾素和橙皮素储备液。

2．2 色谱条件

AZEP C18色谱柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.12%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱程序为0～20 min，94%～85%（B）；20～45 min，85%～75%（B）；45～60 min，75%～35%（B）；60～80 min，35%～15%（B）。流速、柱温、进样量及检测波长分别为1.0 mL·min-1、40 ℃、10 μL及360 nm。在上述色谱条件下，被检测成分R1-R4的系统适用性试验结果显示，分离度（R）大于1.5，达到基线分离效果，理论塔板数（n）均不低于8 000，其HPLC图见图1。

图1 供试液和混合对照液HPLC图谱Fig. 1 HPLC chromatograms of test solution and mixed control solution

2．3 标准曲线绘画及检测范围确定

定量吸取绿原酸和橙皮素储备液适量，用甲醇分别稀释成绿原酸浓度为0.02 mg·mL-1，橙皮素浓度为0.08 mg·mL-1，在 “2.2” 项色谱条件下进行测定，进样量分别为2.5、5.0、7.5、10.0、12.5、15.0 μL，计算其回归方程，结果见表2。

表2 线性关系结果Tab. 2 Results of linear relationship

2．4 精密度试验

在上述色谱条件下，连续进绿原酸和橙皮素对照品溶液6次，计算绿原酸和橙皮素峰面积的相对标准偏差（RSD），分别为0.52% 和0.71%，表明仪器精密度较好。

2．5 稳定性试验

用液相进样针吸取同一供试品溶液（TZ1）10 μL，在上述色谱条件下，分别于0、2、4、6、8、12 h进样，测得峰面积，计算绿原酸和橙皮素相对含量的RSD 分别为1.0%和1.3%，表明供试品溶液在12 h 内基本稳定。

2．6 重复性试验

称取同一供试品（TZ1）6份，每份1.0 g，精密称定，照 “2.1.1” 项下制备样品溶液，进样测定，计算绿原酸和橙皮素相对含量的RSD分别为1.3%和1.4%。

2．7 加样回收率试验

取供试品（TZ1）0.50 g，共6 份，精密称定，按供试品中原有量与对照品加入量比例1∶1的要求分别加入绿原酸和橙皮素对照品适量，按 “2.1.1” 项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算加样回收率和RSD，结果见表3。

表3 加样回收率试验（n=6）Tab. 3 Sample recovery test（n=6）

2．8 样品测定

取15批样品各适量，分别按 “2.1.1” 项下方法制备供试品溶液，再按 “2.2” 项下色谱条件进样测定，记录峰面积并计算样品含量，结果见表4。

表4 样品含量测定结果（n＝3，mg·g-1）Tab. 4 Determination results of sample content（n=3, mg·g-1）

3 讨论

笔者通过本实验对流动相乙腈-水、甲醇-水、乙腈-磷酸水及甲醇-磷酸水等二元梯度洗脱系统进行了考察，结果乙腈（A）-0.12%磷酸水溶液（B），梯度洗脱，B：0～20 min，94%～85%；20～45 min，85%～75%；45～60 min，75%～35%；60～80 min，35%～15%为流动相时，被检测成分绿原酸和橙皮素的分离度效果好，分析时间合理。绿原酸和橙皮素在200～400 nm范围内进行扫描，在360 nm处均最大吸收。

从表2 可见，绿原酸和橙皮素的线性关系（r＞0.999 5）在较宽的浓度范围内表现出良好。从精密度、稳定性和重复性实验结果得出，该方法的精密度、稳定性和重复性均较好，RSD 均小于2.0%；从表3 可见，绿原酸和橙皮素的平均回收率分别为97.64%和97.86%，RSD 也均小于2.0%。从表4 可见，绿原酸和橙皮素在不同批次额日木中相对含量变化分别为（0.423±0.005）～（0.712±0.009）、（0.998±0.012）～（1.403±0.020）mg·g-1。

总之，通过本实验研究，建立了额日木中绿原酸和橙皮素的HPLC分析方法，为额日木后续质量控制研究打下了前期基础。