糖尿病肾病患者外周血lncRNA PACER表达与炎症反应及肾功能进展的关系

张秀云 侯凤英 刘美 胡文静 王麦 雷敏

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是2 型糖尿病常见的并发症之一，表现为白蛋白尿及肾功能减退［1⁃2］。炎症反应是贯穿DN 发生发展的重要生物学环节，涉及多种炎症细胞因子的异常释放，单独依靠某一种或几种炎症细胞因子无法准确且全面的评估DN 病情［3］。近些年相关的基础研究关注长链非编码RNA（long non⁃coding RNA，ln⁃cRNA）在炎症反应中的调控作用，李海燕［4］的细胞实验在肾小管上皮细胞中证实高糖促进lncRNA PACER 的表达，转染siRNA 抑制lncRNA PACER的表达显著抑制高糖诱导的多种炎症细胞因子释放，提示lncRNA PACER 的高表达可能参与DN 的发病。本研究将以DN 患者为对象，分析lncRNA PACER 表达与炎症反应及肾功能进展的关系。

1 对象与方法

1.1 研究对象

选择2018年1月至2020年5月期间在石家庄市第二医院诊断为DN 的2 型糖尿病患者作为DN 组，纳入标准：①符合指南中2 型糖尿病及DN 的诊断标准［5］；②符合指南中慢性肾脏病1～3 期的标准［5］；③按要求留取本研究所需外周血及血清标本；④临床资料完整。排除标准：①其他类型糖尿病；②合并原发性肾脏疾病或有肾毒性药物治疗病史；③合并糖尿病急性并发症。选择同期就诊的尿白蛋白水平及肾功能正常的2 型糖尿病患者作为DM 组，同期体检的健康志愿者作为对照组。DN 组共72 例，包括男性40 例、女性32 例，年龄平均（60.39±10.39）岁；DM 组共80 例，包括男性48 例、女性32 例，年龄平均（60.11±10.24）岁；对照组共88例，包括男性50例、女性38例，平均年龄（59.32±9.29）岁。三组间一般资料的比较，差异无统计学意义（P>0.05）。本研究取得医院伦理委员会批准，获得入组研究对象的知情同意。

1.2 外周血lncRNA PACER 表达水平的检测

取三组受试者的空腹外周静脉血3～4 mL，采用全血RNA 提取试剂盒（北京全式金公司）提取RNA，然后采用lncRNA cDNA 第一链合成试剂盒（北京天根生化公司）将RNA 反转录为cDNA，最后采用lncRNA 荧光定量检测试剂盒（北京天根生化公司）对cDNA 中的lncRNA PACER 进行荧光定量PCR 扩增和检测。反应体系参照试剂盒说明书配置，反应程序为95℃3 min、而后95℃15 s 60℃30 s 72℃30 s 重复40 个循环。完成扩增反应得到循环曲线和循环阈值（Ct），在公式2⁃ΔΔCt中计算lncRNA PACER 的表达水平。

1.3 血清TNF⁃α、IL⁃1β、ICAM⁃1 含量的检测

取三组受试者的空腹外周静脉血5～6 mL，静置30 min 凝血后3 000 r/min、半径5.5 cm，离心10 min，分离血清并采用酶联免疫吸附法试剂盒（上海酶联生物公司）检测TNF⁃α、IL⁃1β、ICAM⁃1 的含量。

1.4 DN 白蛋白尿程度及eGFR 水平的评估

参照指南［5］，根据DN 患者24 h 尿白蛋白水平评估白蛋白尿程度，30～300 mg/24 h 为微量白蛋白尿、>300 mg/24 h 为大量蛋白尿；计算eGFR，≥90［mL/（min·1.73 cm2）］为CKD1 期、60～90［mL/（min·1.73 cm2）］为CKD 2 期、30～60［mL/（min·1.73 cm2）］为CDK 3 期。

1.5 肾功能不良进展的随访及评估

采用门诊或住院复查、电话或网络回访等方式进行随访，随访截止时间为2021年10月31日，与入组时比较，血肌酐水平加倍或进行肾脏替代治疗判断为肾功能不良进展。

1.6 统计学方法

采用SPSS 22.0 软件进行统计学处理，计量资料经正态性检验、符合正态分布，用（）表示，两组间比较采用t检验，两两比较采用LSD⁃t 检验，多组间比较采用单因素方差分析。肾功能不良进展的累积发生率采用K⁃M 曲线描述，采用log⁃rank 检验。以P<0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组lncRNA PACER 表达水平及血清炎症因子含量的比较

外周血中lncRNA PACER 的表达水平及血清中TNF⁃α、IL⁃1β、ICAM⁃1 的含量的三组间比较如下：DN 组>DM 组、DN 组>对照组差异有统计学意义（P<0.05）；DM 组与对照组比较的差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。

表1 各组lncRNA PACER 表达水平及血清炎症因子含量的比较（±s）Table 1 Comparison of lncRNA PACER level and serum inflammatory factor content in each group（±s）

表1 各组lncRNA PACER 表达水平及血清炎症因子含量的比较（±s）Table 1 Comparison of lncRNA PACER level and serum inflammatory factor content in each group（±s）

注：与对照组比较，aP<0.05；与DM 组比较，bP<0.05。

组别DN 组DM 组对照组F 值P 值n 72 80 88 lncRNA PACER 1.21±0.23ab 1.06±0.18 1.00±0.17 14.822 0.000 TNF⁃α(ng/mL)8.51±1.32ab 5.68±0.86 4.01±0.77 23.811 0.000 IL⁃1β(ng/mL)12.74±2.03ab 9.15±1.86 7.24±1.62 17.582 0.000 ICAM⁃1(ng/mL)225.41±36.85ab 172.57±27.38 125.52±18.12 19.508 0.000

2.2 DN 组中不同白蛋白尿程度患者lncRNA PACER 表达水平及血清炎症因子含量的比较

DN 组中大量白蛋白尿患者外周血中lncRNA PACER 的表达水平及血清中TNF⁃α、IL⁃1β、ICAM⁃1的含量均高于微量白蛋白尿患者，差异有统计学意义（P<0.05）。见表2。

表2 DN 组中不同白蛋白尿程度的患者lncRNA PACER 表达水平及血清炎症因子含量的比较（±s）Table 2 Comparison of lncRNA PACER expression level and serum inflammatory factor content in patients with different degrees of albuminuria in DN group（±s）

表2 DN 组中不同白蛋白尿程度的患者lncRNA PACER 表达水平及血清炎症因子含量的比较（±s）Table 2 Comparison of lncRNA PACER expression level and serum inflammatory factor content in patients with different degrees of albuminuria in DN group（±s）

白蛋白尿程度大量白蛋白尿微量白蛋白尿t 值P 值n 30 42 lncRNA PACER 1.31±0.30 1.14±0.27 2.215 0.014 TNF⁃α(ng/mL)10.61±2.03 7.01±1.25 9.300 0.000 IL⁃1β(ng/mL)15.29±3.41 10.92±2.52 6.257 0.000 ICAM⁃1(ng/mL)271.75±35.68 192.31±31.28 10.018 0.000

2.3 DN 组中不同eGFR 患者lncRNA PACER 表达水平及血清炎症因子含量的比较

DN 组患者外周血中lncRNA PACER 的表达水平及血清中TNF⁃α、IL⁃1β、ICAM⁃1 的含量比较：CKD3 期>CKD2 期>CKD1 期，差异有统计学意义（P<0.05）。见表3。

表3 DN 组中不同eGFR 患者lncRNA PACER 表达水平及血清炎症因子含量的比较（±s）Table 3 Comparison of lncRNA PACER expression level and serum inflammatory factor content in patients with different EGFR in DN group（±s）

表3 DN 组中不同eGFR 患者lncRNA PACER 表达水平及血清炎症因子含量的比较（±s）Table 3 Comparison of lncRNA PACER expression level and serum inflammatory factor content in patients with different EGFR in DN group（±s）

注：与CKD1 期比较，aP<0.05；与CKD2 期比较，bP<0.05。

eGFR 水平CKD1 期CKD2 期CKD3 期F 值P 值n 17 34 21 lncRNA PACER 1.09±0.29 1.21±0.27a 1.31±0.32ab 14.952 0.000 TNF⁃α(ng/mL)6.22±1.41 8.36±1.85a 10.61±2.09ab 22.812 0.000 IL⁃1β(ng/mL)9.85±2.05 12.42±2.62a 15.60±2.85ab 19.382 0.000 ICAM⁃1(ng/mL)180.15±30.58 219.57±38.12a 271.50±40.39ab 26.842 0.000

2.4 DN 组患者lncRNA PACER 表达水平与血清炎症因子含量的相关性

DN 组患者外周血lncRNA PACER 表达水平与血清TNF⁃α、IL⁃1β、ICAM⁃1 的含量呈正相关（r1=0.512，r2=0.339，r3=0.452，P<0.05）。

2.5 DN 组中不同lncRNA PACER 表达水平患者肾功能不良进展累积发生率的比较

DN 组中lncRNA PACER 高表达患者的肾功能不良进展累积发生率高于lncRNA PACER 低表达患者，差异有统计学意义（P<0.05）。见图1。

图1 K⁃M 曲线Figure 1 K⁃M curve

2.6 lncRNA PACER 表达水平预测DN 患者肾功能不良进展的ROC 曲线分析

lncRNA PACER 表达水平预测DN 患者肾功能不良进展的预测的ROC 曲线下面积为0.709（95%CI：0.540～0.878，P=0.022）。见图2。

图2 ROC 曲线Figure 2 ROC curve

3 讨论

DN 是常见的2 型糖尿病并发症之一，以白蛋白尿为主要的临床表现，随着病情发展会出现肾功能减退，严重者会进展为终末期肾脏病［6］。因此，发现DN 早期防治的新靶点具有迫切的临床需求，既要寻找早期评估DN 发生发展的分子标志物，也要寻找延缓DN 发展的治疗靶点。

在DN 及其他糖尿病并发症的病理生理进程中，涉及多种lncRNAs 表达的变化，不同的lncRNA可能通过激活炎症反应、氧化应激、细胞凋亡的方式或诱导内皮细胞损伤的方式参与糖尿病并发症的发生发展［7⁃8］。国内李海燕等［4］的研究通过细胞实验对DN 相关的lncRNA 进行了探索，在高糖诱导肾小管内皮细胞损伤的DN 细胞模型中，lncRNA PACER 表达明显增加；转染siRNA 抑制lncRNA PACER 的表达能够减轻DN 细胞模型的细胞损伤。本研究通过临床研究证实：DN 患者外周血中lncRNA PACER 的表达水平显著高于DM 组和对照组，与李海燕的细胞实验结果吻合，提示lncRNA PACER 的高表达可能与DN 的发病有关。

LncRNA PACER 具有促炎的生物学作用，国外多项研究证实该lncRNA 在帕金森病、巨噬细胞极化、多发性硬化、牙周炎等疾病中促进炎症反应的激活［9⁃12］。TNF⁃α、IL⁃1β、ICAM⁃1 是目前已知与DN发病相关的炎症细胞因子［13］。既往研究及本研究均证实DN 患者血清中TNF⁃α、IL⁃1β、ICAM⁃1 的含量明显增加。本研究通过相关性分析证实：DN患者外周血lncRNA PACER 的表达水平与血清TNF⁃α、IL⁃1β、ICAM⁃1 的含量呈正相关，提示DN发病过程中高表达的lncRNA PACER 对多种炎症细胞因子的释放具有促进作用。

在DN 的发病过程中，炎症反应的激活、炎症细胞因子的释放能够作用于肾小球内皮细胞、肾小管水平细胞，引起细胞损害的同时造成白蛋白尿的产生或加重、肾小球滤过功能的减退［14］。本研究进一步对DN 患者进行了白蛋白尿程度及肾小球滤过功能的评估，分析其与lncRNA PACER 的关系可知：大量白蛋白尿的DN 患者及CKD3 期的DN 患者外周血lncRNA PACER 表达水平更高，表明DN 发病过程中高表达的lncRNA PACER 促进了病情的加重，包括使白蛋白尿加重、肾小球滤过功能减退加重。

DN 是目前终末期肾脏病最常见的原因之一，在DN 进展为终末期肾脏病的过程中，肾功能不断减退［15］，因此本研究还对DN 患者肾功能进展的情况进行了随访，将血肌酐水平翻倍或发生终末期肾脏病作为肾功能不良进展的终点事件，经K⁃M 曲线分析：与lncRNA PACER 低表达的DN 患者比较，高表达的DN患者在随访过程中肾功能不良进展的累积发生率更高；经ROC 曲线分析，lncRNA PACER 的表达水平对DN患者肾功能不良进展具有预测价值。

综上所述，外周血lncRNA PACER 高表达与DN病情加重、炎症反应激活及肾功能不良进展有关。