真丝文物霉变菌株的分离、鉴定及防霉药剂筛选

王毅婧，黄阳阳，黄小萃，刘 臣，邱海丽

(苏州市职业大学丝绸应用技术研究所，江苏苏州 215002)

0 引 言

中国自古就以“丝绸之国”享誉国际，古代发达的丝绸纺织业为我们留下了诸多宝贵的文化遗产[1]。近年来各种考古工作中出土了大量的真丝文物，成为了珍贵的丝绸档案[2-3]。然而丝织品是一种天然蛋白质纤维，其储存环境中存在的霉菌等微生物可以以真丝蛋白为营养基质，在适宜条件下迅速繁殖，引起真丝文物霉变，从而导致真丝文物色泽改变、纤维褪化，严重影响真丝文物的保存[4]。因此，对真丝文物防霉技术的研究越来越受到人们的重视。目前对霉变真丝文物的保护工作以霉斑清除及生物技术手段为主[5-7]，而真丝文物由于其蛋白成分及纤维结构的特殊性，即使清除其表面霉斑后，保存不当仍会发生二次霉变。因此，分离出最易引起真丝文物霉变的微生物，并对其进行鉴定，为真丝文物防霉技术的开发提供靶标菌株，同时筛选安全、高效的防霉药剂，对真丝文物长期防霉保护具有重要意义。近年来，异噻唑啉酮及氨基甲酸酯类等防霉剂因其具有长效、低毒、高效、广谱等特点，被广泛应用到各类文物的防霉保护及防霉制品的生产中[8-10]。通过测定不同真丝文物霉变菌株对各防霉药剂的敏感性差异，可以针对性地筛选出真丝文物防霉处理剂，以期为真丝文物防霉控制提供理论基础和防治依据。

1材料与方法

1．1 材料与仪器

1．1．1材料及试剂 霉变黑色团花马褂及霉变元色亮花缎坎肩(图1)，来源于苏州丝绸博物馆于20世纪90年代收集的民国时期民间传世品，馆藏储存温度10～20 ℃，湿度50%～60%；孟加拉红培养基、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(PDA)及察氏培养基，购自北京陆桥技术股份有限公司；3-碘-2丙炔基-N-正丁基氨基甲酸酯(IPBC)、2-甲基-4-异噻唑啉-3-酮(MIT)、苯并异噻唑啉-3-酮(BIT)、聚六亚甲基单胍磷酸盐(PHMG)购自佛山市丽源化工有限公司。

图1 霉变真丝文物Fig.1 Silk relics contaminated by mold

1．1．2主要仪器 SW-CJ-1F型超净工作台，苏州安泰空气技术有限公司；YXQ-LS-50SⅡ型高压灭菌锅，上海博迅实业有限公司医疗设备厂；MJPS-150型霉菌培养箱，上海精宏实验设备有限公司；XSP-2C型显微镜，上海兴行实业有限公司；漩涡振荡器，合肥艾本森科学仪器有限公司。

1．2 霉变菌株分离及鉴定

1．2．1霉变菌株分离、纯化 用无菌棉签轻轻擦拭真丝文物表面霉斑部位，蘸取霉菌孢子，在孟加拉红培养基平板中划线，于28 ℃霉菌培养箱中恒温培养5～7 d形成菌落，选择菌落形态典型、分离效果明显的平板，分别挑取单菌落边缘的菌丝，转接到PDA培养基平板上28 ℃培养7 d进行纯化培养，经此方法3次纯化后获得引起真丝文物霉变的单菌落菌株，转入PDA斜面试管中28 ℃培养7 d，培养后的斜面菌种于4 ℃冷藏箱中保存备用。

1．2．2形态学鉴定 采用点植法将分离纯化后的斜面菌种接种于察氏培养基上，28 ℃培养7 d后观察霉菌菌落形态并制作显微镜镜检切片[11]，记录霉变菌株的生长速度、菌落形态、颜色等特点，显微镜镜检观察霉菌分生孢子梗及分生孢子形态特征，按照《真菌鉴定手册》[12]对分离得到的霉菌进行初步鉴定。

1．2．3分子生物学鉴定 扩增真菌ITS序列使用通用引物ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’，NS1：5’-GTAGTCATATGCTTGTCTC-3’，NS6：5’-GCATCACAGACCTGTTATTGCCTC-3’。PCR反应体系为25 μL，组分为：Template 0.5 μL，10×Buffer 2.5 μL，dNTP 1 μL，酶0.2 μL，上下游引物各0.5 μL。PCR循环条件为：95 ℃预变性4 min，94 ℃变性45 s，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，30个循环，72 ℃修复延伸10 min，4 ℃保存。委托上海生工对分离纯化后的霉变菌株进行序列测定，测序得到的菌株基因序列分别于NCBI核酸序列数据库中进行BLAST分析，与已知序列进行对比，进行同源性分析[13]。利用MEGA7软件进行多序列比对，采用邻接法(Neighbor-Joining)构建系统发育树。结合霉菌的形态学特征确定真丝文物各霉变菌株的分类学地位。

1．3 防霉药剂筛选

1．3．1防霉剂药效 试验按照IPBC、MIT、BIT、PHMG的药剂使用说明书及预实验结果，分别将四种防霉剂稀释为5个浓度梯度(表2)。分别取10 mL无菌水加入到纯化培养好的各斜面菌种中，用无菌接种环轻刮表面洗出霉菌孢子，将洗出的孢子液倒入含玻璃珠的离心管中，4 000 r/min离心10 min，去掉上清液，加入50 mL无菌水离心洗涤沉淀三次，用无机盐营养液稀释洗涤后的沉淀，制备霉菌孢子悬浮液，血球计数法计数，控制霉菌孢子悬浮液浓度为1×106个/mL～5×106个/mL[14]。取0.5 mL孢子悬浮液接种至PDA培养基平板中，涂布均匀，将无菌牛津杯置于培养皿中心，取不同浓度的各药剂0.2 mL分别加入到牛津杯中，每个浓度重复3次，无菌水做对照，28 ℃培养7 d观察药效。

1．3．2药效试验数据处理 采用十字交叉法测量抑菌圈直径，根据抑菌圈直径占含菌培养基直径的百分率计算相对抑菌率[15]。以防霉剂各浓度对数值为自变量x，相对抑菌率为因变量y，建立防霉剂毒力回归方程，计算抑制中浓度EC50[16]。

2 结 果

2．1 霉变菌株形态学观察

通过平板纯化，从霉变真丝文物中共分离4株霉菌，分别编号为A、D、H、K。依据霉菌形态学培养方法对各菌株进行培养，选取典型菌株进行形态学观察，为霉变菌株的鉴定提供参考。各菌株在察氏培养基上的菌落形态、分生孢子梗及分生孢子等显微形态特征如图2所示。

图2 霉菌菌落形态与显微形态Fig.2 Colony morphology and microscopic shape of mold strains

菌株A：生长速度中等，菌丝体较长、白色，呈辐射状向周围生长，菌落背面呈黄橙色。分生孢子梗与菌丝明显不同，分生孢子梗光滑、无色、无分枝、有隔膜。

菌株D：生长速度缓慢，菌落呈绒毛状、乳白色，菌落背部呈浅橙色。分生孢子梗光滑、无色、有分枝、有隔膜。分生孢子小而光滑，球形或亚球形。

菌株H：生长速度缓慢，菌落呈绒毛状，初期呈白色，后变为绿褐色。分生孢子梗无膨大，线形，单生，暗色，有分隔；分生孢子卵圆形、椭圆形或纺锤形，无色，光滑，有隔膜0～2个。

菌株K：生长速度缓慢，菌落呈绒毛状，灰绿色至黑色，边缘白色，菌落表面有褶皱。分生孢子梗单枝或稍分枝，线形，有曲折，暗色，有分隔；分生孢子呈链状，卵圆形或椭圆形，无色，光滑，有隔膜。

2．2 分子生物学鉴定结果

将4株霉菌的基因序列与NCBI核酸序列数据库中收录的基因序列进行同源性比对，选取数据库中参照序列同源性最高的霉菌标准序列为参比对象，测序比对结果见表1。选取同源性最高的相关菌株进行同源性分析，构建系统发育树(图3)，确定菌株的分类学地位。

表1 4株霉菌同源性比对Table 1 BLAST results of the 4 mold strains

根据系统发育树分析结果，结合不同菌株形态学特征和同源性比对结果，确定4株菌株按照亲缘关系分别属于半知菌类丛梗孢目的3个属：丛梗孢科曲霉族曲霉属(Aspergillus)，暗梗孢科节孢霉族节孢霉属(Arthrinium)，暗梗孢科双孢亚科芽枝霉属(Cladosporium)。其中A、D分别属于节孢霉属和曲霉属，H、K属于芽枝霉属。同源性比对结果显示，与4株霉变菌株同源性高于99%的序列较多。通过图2形态学观察可知H与K虽属于同属但不同种。图3表明，A、D、H、K菌株在分类学上分别与KP269008．1、KT310987．1、KP278171．1、KX078479．1的亲缘关系更近，但尚不足以鉴定到具体的种。

图3 基于ITS基因序列构建系统发育树Fig.3 Phylogenetic tree established on the basis of ITS

2．3 防霉剂药效结果分析

根据4种防霉剂的抑菌效果建立不同菌株毒力回归方程，试验结果显示4种防霉剂有效成分含量与抑菌率相关系数均达显著水平，不同防霉剂对供试霉菌均有一定的抑制效果，且抑制效果均与药剂浓度呈正比，但是不同防霉剂对不同真丝文物霉变菌株的抑制效果差异较大。4种防霉剂中PHMG及BIT的抑菌效果相对较低，其中PHMG对菌株A及菌株H的毒力较低，EC50分别为4 093.028 3 mg/L及2 949.672 2 mg/L；BIT对菌株D及菌株K的毒力最小，EC50分别为2 082.539 5 mg/L和5 584.528 7 mg/L。同一类型的防霉剂对不同真丝文物霉变菌株的抑菌效果也具有较大差异，供试防霉剂中BIT与MIT均属于异噻唑啉酮类药剂，其中BIT对4种真丝文物霉变菌株的抑制作用较小，而MIT对A、H及K菌株的毒力均优于其他3种防霉剂，EC50分别为56.235 5 mg/L、292.173 7 mg/L及190.045 6 mg/L，对D菌株的毒力仅次于IPBC，EC50为62.681 5 mg/L。IPBC的综合毒力仅次于MIT，对菌株D的毒力最高，EC50仅为27.454 0 mg/L，对菌株A、H及K菌株的EC50分别为250.283 0 mg/L、480.325 7 mg/L及997.239 2 mg/L(表2～5)。由此可以看出，MIT及IPBC对真丝文物霉变菌株有良好的抑制效果，具有一定的推广应用前景。

表2 4种防霉剂对菌株A的毒力测定Table 2 Toxicity of 4 kinds of fungicides on Strain A

表3 4种防霉剂对菌株D的毒力测定Table 3 Toxicity of 4 kinds of fungicides on Strain D

表4 4种防霉剂对菌株H的毒力测定Table 4 Toxicity of 4 kinds of fungicides on Strain H

表5 4种防霉剂对菌株K的毒力测定Table 5 Toxicity of 4 kinds of fungicides on Strain K

3 讨 论

研究显示霉变真丝文物中芽枝霉属霉菌在真丝文物中污染情况较为严重，本研究分离得到的霉变菌株种类与真丝文物中经常出现的霉菌种类基本一致[5，17]。由于采样点的局限性，本研究仅分离得到4株真丝霉变菌株，且均是从霉变真丝文物表面直接取样得到的，不能全面反映真丝文物的霉菌污染情况。今后可对真丝文物存放环境中的霉菌取样鉴定以进行对比，进一步研究不同存放环境对真丝文物霉变的影响。霉菌在真丝文物表面生长不仅会影响真丝文物的保存，同时霉菌产生的代谢物亦会对人体产生危害[18]。

4 结 论

本研究测定了4种防霉剂对4株真丝文物霉变菌株的毒力，结果显示MIT和IPBC对4株真丝文物霉变菌株的抑菌效果较好，后续可利用此两种防霉剂对真丝文物表面进行防霉处理。另外本研究仅对4种防霉剂的单一防霉效果进行了探讨，多种防霉剂复合使用对真丝文物霉变菌株的防治效果还有待进一步的研究。本研究通过对真丝文物霉变菌株的鉴定及防霉药剂的筛选，为进一步探究如何抑制真丝文物表面的霉菌生长，降低霉菌污染的危害，延长真丝展品及文物的保存提供了有效依据。