液相色谱质谱联用法研究红花染纺织品褪色分子机理

魏 乐

(故宫博物院文保科技部，北京 100009)

0 引 言

植物染色采用自然界中自然生长的植物通过不同工艺提取色素对有机无机材质进行染色，距今已有5 000年的历史[1]。红花(CarthamustinctoriusL．)，又名红蓝花，刺红花，属双子叶菊科红花属草本植物，最早记录于公元前4世纪到公元前3世纪传入我国[2]。红花染自古以来一直出名，明代宋应星《天工开物》彰施篇记载了红花种植、采摘、染色的详细过程。红花属直接型染料，染红色主要显色物质是红花苷，不需要加媒染剂可直接进行染色。红花中红花黄色素和红花红色素，含量分别约占30%和0.5%，为了染出红色，需要采用“杀花法”调节染浴pH至碱性，将红花红色素提取出来对纤维进行上染。红花能够染出漂亮明艳的红色但极易褪色，作为中华传统服饰艺术中最明艳的色彩，亟须在分子水平上明确阐明褪色机制，这对博物馆馆藏文物及文化遗产的保护具有重要意义。

红花苷的最初研究是20世纪90年代，Kanehira等[3]对温度、pH、光照，缓冲液体系等因素作了充分考量，实验发现红花苷溶液体系在较高温度更易分解为偏黄色副产物。稳定性明显与pH值密切相关，在pH值为1.5～5.5的范围内最为稳定。紫外光照射下更容易发生衰解。在不依赖缓冲体系、外部气相环境或某些化学物质暴露情况下，也会出现褪色现象。博物馆环境影响纺织品褪色的因素是方方面面的，其中最直观的影响因素是光照，无论纤维本体还是其上附着的染料分子均对光敏感。在一定的温湿度条件下，酸性气态污染物容易造成纺织品文物染料的褪色，另外臭氧具有极强的氧化性，对有机物中不饱和双键易发生环加成，促进染料分子的降解[4]。对红花中其他组分的鉴定，Wouters等[5]最初鉴定出红花色素中的四种无色组分鉴定标志物，分别为Ct1，Ct2，Ct3和Ct4。这些组分的化学性质不同于红花苷，能经受住强烈的酸水解或者光诱导加速老化。对红花苷降解成分的研究，Laursen等[6]首先明确了其在水溶液中加热变质的原因为通过逆向羟醛缩合，形成carthamin A和B两种副产物，通过碳碳双键的氧化最终形成对羟基苯甲醛和对羟基苯甲酸小分子。Costantini等[7]发现不仅光照引起红花染的褪色，阴暗高湿的储存条件也会引起褪色现象。但可通过高效液相色谱偶联光电二极管矩阵检测器在褪色文物上检测到染料鉴定标志物Ct组分确定为红花染。

有机染料分析一直是文化遗产保护的重要内容，通过鉴定小分子标志物确认文物所用染材。通常染料小分子不够稳定，在一定的环境因素作用下发生降解，因此分析特定染料可能的变化过程有助于加强对纺织品文物的保护。对考古材料和馆藏传世文物的染料检测应用最为广泛的方法是高效液相色谱法，结合高分辨质谱检测器，可对组分分子量和结构信息作全面准确地判断，具有高的灵敏度和特异性，可以实现微损分析[8]。除了可以进行常规定性定量鉴定外，还可对染料中存在的老化产物进行推测。博物馆馆藏纺织品文物引起劣化主要因素是光照[9]，因此本研究首先从紫外光和LED两种光源照射出发，对直接显色成分红花苷不同影响因素作详细分析。表征手段主要采用超高效液相色谱四极杆飞行时间质谱联用仪对红花染现代模拟品及故宫院藏珍贵纺织品历史文物进行检测。通过对低能通道不同加合离子产生的分子离子峰以及高能通道碎片的解读判断分子裂解规律从而合理解释化学结构。研究结果进一步证实了可能存在的老化分子，并从液质相对含量的变化上讨论可能的变化过程。本研究首次经液相色谱质谱联用确证三香豆酰亚精胺实际为Ct4组分在红花中的存在，结合现代品和文物样品推测了红花染产生这种化合物的工艺原因。实验发现甲酸容易引起红花苷黄变，并对原因进行了分析。

1 实验样品与方法

1．1 实验样品

故宫博物院院藏织绣文物粉色缎绣折枝花纹宫衣，如图1a所示，属清乾隆时期二级戏衣文物。身长126 cm，腰宽52.3 cm，两袖通长198.2 cm，袖宽33 cm，石青缎领长39.6 cm、宽18.5 cm。对文物存在的开线，磨损，领水渍等伤况由文保科技部修复后于2019年12月在香港科学馆举办的“内里乾坤-故宫文物修复展”进行参展。灰色彩绘百褶裙粉色里子存在明显褪色，如图1b所示，对残落物(图1c)进行实验检测。清代《出门见喜》春条，采用传统缂丝工艺织造而成，长60 cm，宽26 cm。整体修复前伴有不同程度的脏污、虫蛀，由文保科技部修复后在故宫博物院寿康宫作原状陈设。文物正面(图2b)长期日晒同背面(图2a)相比较出现明显褪色，分别对正面(图2c下)背面(图2c上)残落物进行实验检测。红花染老化前后样品来源于甘肃省博物馆的实验模拟品(图3)，图片从左至右分别为未老化，紫外光老化、LED光老化样品。

图1 粉色缎绣折枝花纹宫衣文物图像Fig.1 Pictures of a pink embroidered costume with picked-branch patterns

图2 缂丝出门见喜春条文物图像Fig.2 Pictures of Kesi fabric with the scroll

图3 红花染老化前后对比照片Fig.3 Before and after aging of safflower-dyed textiles

1．2 老化光源条件

紫外老化设备采用东莞利鑫仪器设备有限公司UVA-340紫外耐候试验箱，光源采用UVA-340紫外线灯管，光源波长340 nm，光源功率15 W，置放试样用网架规格63 cm×34 cm，内箱尺寸70 cm×35 cm×30 cm。LED老化设备采用欧科ERCO ogotec轨道射灯，光源功率12 W，LED灯色温4 000 K。老化时间均为25 d。

1．3 实验试剂及提取

所用提取试剂均为分析纯，北京化工厂。色谱流动相乙腈为色谱级，美国Fisher公司；纯水来源于超纯水仪(德国Merck Milli-Q)。标准品三香豆酰亚精胺，购自云南西力生物技术股份有限公司，纯度98%。模拟染色样品及文物样品提取条件采用两步提取法即对同一样品的两次提取分步进行，第一步分别向样品中加入200 μL N，N-二甲基甲酰胺(DMF，Merck，顶空气相色谱级)，放入加热器100 ℃加热10 min冷却后，离心机12 000 r/min离心5 min吸取上清液待测。提取第二步将前述样品加入200 μL浓盐酸甲醇水混合体系(体积比2∶1∶1)，放入加热器100 ℃加热10 min冷却后，取上清液12 000 r/min，5 min离心。用医用注射器将上清液吸取出来氮气吹干，再用30 μL甲醇复溶用于液质检测。

1．4 液相色谱质谱联用条件

液相条件采用Waters Acquity H-Class UPLC进行测试，BEH C18(2.1×100 mm，1.7 μm)色谱柱；柱温30 ℃；流动相A为0.1%甲酸水溶液，B为乙腈；梯度条件：0～0.3 min：95%A；0.3～9.3 min：95%～5%A；9.3～10.3 min：5%A；10.3～10.5 min：5%～95%A；10.5～12 min：95%A；流速0.25 mL/min；进样量均为2 μL。质谱条件采用Waters Xevo G2-XS Q-TOF MS进行测试，质μ量扫描范围m/z50～1 200；采用全信息串联质谱方法(MSE)正负模式下进行数据采集。ESI电离源，源温：120 ℃；脱溶剂气为氮气，脱溶剂气温度为450 ℃，流速为800 L/h；毛细管电压为3 kV，锥孔电压40 V，碰撞能量20～40 eV。采用亮氨酸脑啡肽作为实时校正液，浓度为0.4 ng/L，每隔30 s进样一次。整个系统由Waters MassLynx软件进行控制，实验数据采用ApexTrack积分方法由Waters UNIFI软件进行处理。

2 结果与讨论

2．1 色差计读数

采用X-Rite 8400型色度计D65光源、10°观察角的方法对模拟样品读取颜色值(表1)。受光老化影响，颜色参数L*有所增加，a*有所降低，由于光照引起丝的黄变b*相应增加。通常认为色差值超过3可作为色差明显的依据[7]，根据CIE LAB色差计算公式得出紫外光老化和LED光老化色差值分别为17.17和1.61，紫外反射光谱曲线相差较大，紫外光下色差显著因而褪色更加明显。博物馆陈列LED灯是光源种类的一种，对纺织品仍具有一定的损伤[10]。

表1 红花染老化前后纺织品的颜色特征值Table 1 Color characteristic values of simulated aging safflower-dyed textiles

2．2 红花染特定成分的液质鉴定

红花染纺织品上检测到的染色相关组分有：红花苷、芹菜素、Ct4、unkown937E式和Z式、Carthamin A、Carthamin B、对羟基苯甲醛(4-Hydroxybenzaldehyde)、对羟基苯甲酸(4-Hydroxybenzoic acid)以及醇化物。主要成分保留时间、分子离子峰、高能裂解碎片列于表2中。近些年对染料色素的提取，大量文献报道通常采用两步法提取[11]，本实验将两步法分开进行，这样可以细微检测老化产物小分子。第一步提取发现尽管吡啶对红花苷是一种比较好的溶剂但毒性较强，具有强烈刺激性气味。DMF同吡啶相比较化学性质相似，均为弱碱性有机溶剂，但萃取效率更高，毒性更低[12-13]，更适于还原染料和直接染料的提取。鉴于博物馆常规检测需求，对红花染样品采用DMF萃取，对老化褪色产物小分子更易检出。

表2 相关检测化合物的液质结果信息Table 2 Results of tested components by liquid chromatography-mass spectrometry

2．2．1红花苷及芹菜素的检测 在红花染模拟品及文物样品中均能检测到主要成分红花苷，是一种高度π共轭的二聚体结构。芹菜素是一种天然黄酮类化合物，作为非显色物质也可检测到，这两种成分主要在第一步DMF提取液中检测存在，液质结果均和标准品进行对照确认。其中芹菜素在红花染现代样品及文物中均存在，这一发现不同于Jan Wouters只在文物样品中存在的报道[5]。

图4为红花苷负离子模式液相色谱质谱结果。特征保留时间在5.01 min，对应的分子离子峰m/z909.208 1(0.8 mDa)。根据高能裂解碎片显示，分子结构中断裂对羟基苯乙烯基产生碎片m/z789.150 9(C35H33O21，1.1 mDa)；红花苷中心位点碳碳双键断裂分别产生m/z461.107 2(C22H21O11，1.7 mDa)和m/z447.094 9(C21H19O11，1.6 mDa)的分子碎片峰，后者继续断裂一分子糖产生m/z287.055 7(C15H11O6，0.1 mDa)，再继续断裂苯酚基产生m/z190.992 9(C9H3O5，5.7 mDa)。如果红花苷在中心位点结合羰基断裂产生m/z501.103 4(C24H21O12，0.4 mDa)的碎片，同时产生m/z407.097 8(C19H19O10，0 mDa)的分子碎片。在同一六元环相对称的位置如果发生两处断裂产生碎片m/z721.161 3(C32H33O19，0.3 mDa)。红花苷为红花染主要显色物质，紫外吸收图谱显示最大吸收波长为520 nm。

图4 红花苷负离子模式液质结果Fig.4 LC-MS results of carthamin by UPLC-ESI-QTOF-MS in negative mode

芹菜素，相应保留时间为5.21 min，负离子模式分子离子峰m/z269.043 8(1.2 mDa)，属典型二氢黄酮类，主要分子骨架为2-苯基色原酮，分子断裂后主要产生m/z107.0132(C6H3O2，0.1 mDa)，m/z117.033 7(C8H5O，0.3 mDa)，m/z151.004 5(C7H3O4，1.4 mDa)三个分子碎片。紫外最大吸收波长为336 nm。紫外吸收、液相色谱质谱、分子结构及主要断裂方式见图5。

图5 芹菜素负离子模式液质结果Fig.5 LC-MS results of apigenin by UPLC-ESI-QTOF-MS in negative mode

2．2．2对未知组分Ct4的结构鉴定 Wouters等[5]首次报道曾经在红花中检测出这种成分，作为一种未显色组分标志物虽然在文献中有所报道[14]，但化合物结构一直没有鉴定。采用液质联用MSE采集方法分别在正负离子模式下均可进行鉴定，以正离子模式为例，色谱图、高能碎片质谱图、紫外吸收及分子裂解方式如图6所示。通过正负模式进行比较确定未知物的分子量为583。因正负模式分子离子峰为偶数，根据氮素规则，推测天然产物中应该含奇数个氮，最终确定可能中性分子式为C34H37N3O6，负模式下质量偏差1×10-7，正模式下质量偏差0。

化合物的紫外吸收位于229 nm、293 nm(肩峰)和318 nm，紫外吸收光谱与肉桂酰胺类似[15]。正离子模式高能碎片m/z164．070 9(C9H10NO2，0.3 mDa)断裂碎片离子[M+H-CONH]+产生m/z119.049 5(C8H7O，0.2 mDa)，同时考虑到紫外光谱提供的信息，推断化合物含有4-羟基肉桂酰胺分子结构片断[16]。分子中断裂一个酰胺键-CONH-产生两个碎片分子m/z147.044 7(C9H7O2，0.1 mDa)和438.239 7(C25H32N3O4，0.4 mDa)，后者继续断裂一个酚羟基产生m/z420.228 7(C25H30N3O3，0 mDa)。同时还能检测到断裂两处酰胺键-CONH-产生的碎片分子m/z292.202 5(C16H26N3O2，0 mDa)，继续断裂碎片中伯胺基产生碎片m/z275.176 2(C16H23N2O2，0.2 mDa)。分子中叔胺基键断裂，还会产生204.102 5(C12H14NO2，0 mDa)和218.117 8(C13H16NO2，0.2 mDa)，两者分子量相差14即一个亚甲基-CH2-，若均除去4-羟基肉桂酰胺基(前述m/z164)可分别计算得到含碳数分别为3和4。即化合物中含有三个4-羟基肉桂酰胺的分子结构，其中两个通过C3和C4烷基碳链偶联。为了进一步验证，采用三香豆酰亚精胺化学标准品同红花染纺织品提取液进行二级质谱MSMS检测，谱图对照如图6e～6f所示，Ct4与三香豆酰亚精胺具有相同的色谱保留时间，在相同的碰撞能条件下具有相同的裂解模式，同时根据高能碎片和紫外吸收光谱并依据文献[17]进行考证比对，最终确定化合物为三香豆酰亚精胺。

图6 三香豆酰亚精胺正离子模式液质结果Fig.6 LC-MS results of tricoumaroyl spermidine by UPLC-ESI-QTOF-MS in positive mode

2．2．3滴加挥发性有机污染物甲酸黄变现象的阐述 红花苷对pH极度敏感，活化能在pH 5.0、12.0时分别为15.6、16.8 kcal/mol[18]。博物馆环境常见挥发性有机污染物(VOCs)容易产生一定的酸性，为了检测可能的影响，在实验色素提取过程中，在红花染丝织品上滴加不同含量甲酸。实验采用10%甲酸水溶液、20%甲酸水溶液、50%甲酸水溶液、80%甲酸水溶液、纯甲酸，分别滴加在红花染现代模拟品上，发现50%甲酸水溶液的条件即可产生瞬间黄变现象，甲酸含量更高，黄变现象更显著。取少量样品滴加纯甲酸进行实验，检测可能的反应产物。

滴加甲酸后，Ct4与红花苷相对比例变大，红花苷部分水解。滴加甲酸发生黄变主要在烯烃双键的反应位点和氢离子发生亲电加成。甲酸在反应体系里作为pH调节剂[19]，同时作为反应剂参与双键的加成反应，产生特征保留时间分别为5.04 min和5.26 min两种强度不等的化合物，负离子模式分子离子峰均为937，色谱结果如图7a所示。两种未知化合物与红花苷紫外吸收图谱基本相似(图7b)，分子结构比较类似。红花苷紫外最大吸收波长为520 nm(RT4.96 min)，保留时间为5.04 min的未知物紫外最大吸收波长为523 nm，根据伍德沃德规则未知物里应额外多出一个环外双键。从高能质谱结果(图7c)来看，两种化合物同红花苷裂解规律类似，两种化合物分子结构应为同分异构体，保留时间为5.26 min未知物紫外最大吸收波长为520 nm，最大吸收波长偏小能量偏大，推测两种化合物为顺反异构体，分别为E式和Z式(图7d)，保留时间靠前的能量较低、结构相对稳定、含量相对较高。

图7 甲酸黄变产物负离子模式液质结果Fig.7 LC-MS results of the yellowing products caused by formic acid by UPLC-ESI-QTOF-MS in negative mode

分子断裂机理方面以负离子模式保留时间为5.04 min未知物为例，分子离子峰m/z937.201 9(2.0 mDa)，断裂醛基-CHO生成碎片分子m/z909.206 1(C43H41O22，2.8 mDa)。红花苷在中心位点结合醛基断裂产生特征碎片分子m/z529.098 4(C25H21O13，0.2 mDa)，继续断裂-CHO产生分子碎片m/z501.103 3(C24H21O12，0 mDa)。其他特征碎片峰与红花苷断裂相似。

2．2．4光老化产物的检测 臭氧作为空气中的污染物，具有强氧化性，光老化作用下，参与红花苷的降解反应。本实验在紫外光和LED两种光源老化模拟品及两件文物上均检测到Richard Laursen报道[6]的四种老化产物小分子Carthamin A、Carthamin B、对羟基苯甲醛和对羟基苯甲酸，如图8所示。

图8 负离子模式下的目标产物提取离子流色谱图及分子断裂方式Fig.8 Extraction chromatograms and molecular structure fragmentations of target products by UPLC-ESI-QTOF-MS in negative mode

2．3 机理讨论

当用红花染红后，如图9所示，一部分芹菜素可以和红花苷一起上染到纤维上，但提取色谱图积分峰面积比例相对数不高。两种老化方式相比较，紫外光老化样品上红花苷与芹菜素的相对峰面积比例明显变少。文物样品喜字春条背面与紫外老化、宫衣样品与LED老化的红花苷与芹菜素比例相对数比较接近。宫衣样品和LED老化同红花染未老化样品比例相对数更加接近。春条正面褪色明显，红花苷降解严重，两种成分比例相对数最低。实验发现红花苷与三香豆酰亚精胺在红花染未老化、紫外老化和LED老化三种纺织品中比例相当。三香豆酰亚精胺这种成分主要在红花染现代品中存在，在品相保存较好的文物样品(宫衣和春条背面)中含量较少。文物春条正面长期日晒褪色，大量红花苷发生降解，使原本微量存在的三香豆酰亚精胺含量相对提高。在出现明显褪色情况下，红花苷发生降解，三香豆酰亚精胺可明显检测到。三香豆酰亚精胺化学纯品呈黄色，红色红花苷的降解，使春条文物正面外观呈现橘色打底，而背面因为褪色不明显依然能看出红色打底。红花属双子叶菊科植物，而三香豆酰亚精胺主要存在于双子叶植物花粉粒中，作为一种特殊代谢产物，参与植物的发育、繁殖[20]。红花通常在早晨开花授粉，完成后即迅速败落。《天工开物》里记载红花是“侵晨带露摘取”，即趁着晨露天凉尽快采摘。古人的这种作法一种解读是为了提高红花品质就要减少花粉授粉的过程，而采摘的鲜花花粉在外界环境中很快失去生活力，因而在宫廷技艺精湛保存相对完好没有褪色的文物样本中这种物质含量相对较少，在红花染褪色文物中可显著检测到。现代进行采摘红花，可能未完全遵照古人的方式，三香豆酰亚精胺的存在是古代和现代红花染色工艺差别的一个指标，可作为检验现代红花染工艺原材料采摘质量的一种衡量方式。天然染料染色中以花瓣作为染材的植物是否均存在这个问题，还需要在今后实验中作进一步的验证。

图9 不同红花染样品中红花苷分别与芹菜素、三香豆酰亚精胺的比例相对数变化Fig.9 Relative ratios of peak areas of carthamin to apigenin and tricoumaroyl spermidine respectively in different safflower-dyed textiles

红花苷主要发生反应位点在中心碳碳双键，强酸弱酸环境均能发生反应。在弱酸条件容易发生黄变，前面已述。通过液质检测发现，采用第二步盐酸提取方法即在强酸作用下，模拟红花染样品产生红花苷强酸水解的醇化物，实验中发现在弱酸作用下并不会产生这种化合物。负离子模式下保留时间为2.95 min，分子离子峰为927，经确定为红花苷碳碳双键水解生成的醇化物。从反应机理上来看三级碳正离子更有利于发生亲电反应，因此本研究结构更倾向于生成叔醇。

胡玉兰等[21]采用光纤光谱仪研究发现，在无氧环境红花染丝织品褪色受到了抑制，说明红花的褪色与氧有关。酸性体系光引发条件下单线态氧与进攻位阻小的碳碳双键发生[2+3]环加成反应[22]，生成三氧杂环戊烷类化合物，这种亚稳态极其不稳定，发生进一步断裂分解生成carthamin A和carthamin B两种类型化合物[6]。这种周环反应的发生尽管可以分步写出反应，但一般没有亚稳态中间体的出现，在靛蓝中也有类似反应的发生[23]。对结构中空间位阻小的碳碳双键继续发生上述反应，最终生成小分子对羟基苯甲醛及其进一步氧化产物对羟基苯甲酸(图10)。

图10 光老化降解反应机理Fig.10 Photoaging degradation mechanism

红花染模拟老化品和褪色文物主要老化产物为对羟基苯甲醛和对羟基苯甲酸，分别进行提取积分研究红花苷的降解率。结果表明未老化、紫外老化、LED老化红花苷降解率分别为0.23%，1.85%，0.48%。两种老化结果表明紫外光对红花苷的破坏作用更大。文物样品红花苷的降解程度更为严重，宫衣文物降解率为3.06%，喜字春条背面降解率为2.48%，褪色明显的春条正面降解率达37.18%，表明光照对纺织品损伤极为严重，产生更多降解产物小分子。这种不可逆的变化强调了宫廷纺织品文物在博物馆馆存环境研究的必要性，亟须加强保护。

3 结 论

本实验主要采用液相色谱质谱联用的方法，以红花染丝织品为主要老化研究对象，采用文献报道两步法对染料进行提取，逐步对染料降解及提取过程中产生的副产物进行检测，研究了红花苷褪色成因，主要结论有以下几点。

1) 鉴定出红花中一种原有报道Ct4的详细结构，成分名称为三香豆酰亚精胺，实质上是植物花粉中的代谢产物，作为非显色组分标志物，虽然在褪色红花染样品和文物样品中均可检测到，但在保存相对完好的文物中这种化合物相对含量极低，与染色工艺直接关联，古代精湛的工艺可以尽可能除去红花中的非有效染色杂质。

2) 采用紫外光和LED两种光照老化方式，研究发现前者对红花苷产生明显褪色现象，与老化前相比较，色差值达17.17，红花苷降解率为1.85%。通过液质联用分析手段进一步证实紫外光照射对纺织品文物具有极强破坏作用。采用LED光源，在色差极微弱的情况实质对纺织品染料的成分也是有一定的损伤。

3) 红花苷主要光老化产物经液相色谱质谱鉴定进一步证实有carthamin A、carthamin B、对羟基苯甲醛和对羟基苯甲酸。采用盐酸甲醇混合体系提取法，还可以检测到叔醇醇化物。甲酸容易造成红花苷发生黄变，主要发生碳碳双键加成生成带有甲酰基的顺反异构体。甲酸属于一类常见的挥发性有机物(VOCs)，红花苷甲酸黄变现象说明其对红花染样品具有重要危害，从博物馆预防性保护工作角度出发要高度重视痕量甲酸含量的实时监测。

4) 博物馆馆藏红花染文物多数存在褪色现象，应减少光照辐照剂量，尽量避免紫外光照射。本研究主要对染色涉及到的显色组分红花苷参与到的反应及实验现象进行分析，天然染料植物成分复杂，今后的工作中仍需深化挖掘更多新型未知组分。