分子对接技术在药物化学实验中的教学实践

席佳越， 张东旭， 聂慧芳， 刘雪英， 李晓晔

(中国人民解放军空军军医大学 药物化学与药物分析学教研室， 西安 710032)

0 引 言

2018年，时任教育部部长陈宝生在教育部高等学校教学指导委员会成立会议上强调：“要把本科教育放在人才培养的核心地位、教育教学的基础地位、新时代教育发展的前沿地位。要深入学习贯彻全国教育大会精神，全面振兴本科教育”。2020年全国教育工作会议上，再次强调，把本科教育抓落实[1]。

抓好本科教育，就应全面改革教学方法、优化课程建设，理论与实践并行，做到与时俱进。但当下的本科教育，多出现“重理论、轻实践”的现象，因此，实验教学成为不可忽视的一环。为了提高我系实验教学质量，一方面丰富实验内容，剔除陈旧实验，增加创新探索实验，做到学科交叉；另一方面，将科研常用技术引入实验教学中，去培养学生的科研思维和综合能力。以药物化学实验课为例，药物化学作为药学领域桥梁学科，是以无机化学、有机化学为基础，同时融合细胞生物学等生命学科的综合性交叉学科，而药物化学实验作为理论课的补充与延伸，不光要重视学生合成能力的培养，更应该培养他们树立药物设计基于靶点的观念[2-3]。

计算机辅助药物设计(Computer Aided Drug Design，CADD)是随着分子生物学、X射线晶体学的大力发展，计算机科学的迅速崛起而产生的[4-5]。CADD是以计算机化学为基础，通过计算机模拟、计算和预测小分子与生物大分子间的关系，从而设计和优化先导化合物的方法[6]。运用CADD，美国科研人员开发的新化合物能更好地维持对耐药HIV突变株的抵抗性[4,7]；运用网络药理学和分子对接技术，北京中医药大学探究出射麻口服液治疗新型冠状病毒的作用机制[8]。运用计算机辅助药物设计，可以大大加速新药研发进程，提高药物研发的成功率、缩短新药研发周期和降低成本。如今，随着这项技术的快速发展和广泛应用，它已成为药学、化学、医学、计算机学等科教人员必备的技能之一。分子对接技术作为药物设计的核心[4]，是一种模拟生物大分子与配体小分子结合及结合强度的计算，通过分子对接的方式，评价配体小分子与受体的生物活性[9]。鉴于此，本教研室对药物化学实验课进行改革，将分子对接技术引入2018级药学四年制本科生实验内容中去，通过学习分子对接软件，模拟药物与靶点的相互作用，更进一步加强学生对药物化学理论课的学习与巩固，全方面提升学生实验综合素养。

1 分子对接专题——以环氧化酶(COX)对接为例

1.1 实验目的

(1) 熟悉Protein databank数据库的使用；

(2) 掌握CDOCKER对接方法与流程，能分析出蛋白与小分子间的作用力；

(3) 了解COX酶蛋白结构。

1.2 实验原理

分子对接是药物设计的重要方法之一，其本质是两个或多个分子之间的识别过程，涉及分子之间的空间匹配和能量匹配，最终找到最佳的结合模式。

分子对接最初思想起源于Fisher E.的“锁和钥匙模型”，该理论认为“锁”和“钥匙”相互识别的首要条件是它们在空间形状上要互相匹配。然而，配体和受体分子之间的识别要比“锁和钥匙”模型复杂得多。首先，配体和受体分子的构象是变化的，而不是刚性的。配体和受体在识别过程中会互相适应对方的结构，从而达到更完美的匹配。其次，分子对接不但要满足空间形状的匹配，还要满足能量的匹配，这就衍生出目前常用的“诱导契合”理论[10](见图1)。

(a) 锁钥模型

分子对接常用的方法有3种：刚性对接、半柔性对接和柔性对接(见表1)[11]。常用的软件有：CDOCKER(Discovery Studio)、GOLD、AutoDock、Glide(Maestro)等。而本实验采用CDOCKER半柔性对接方法完成对接。

非甾体抗炎药中涉及到一个重要的靶点就是环氧化酶(COX酶)，COX酶包含COX-1和COX-2，二者在氨基酸系列上有60%的同源性。在结构上，COX-1与COX-2都在通道一侧的120位存在一个极性较大、可与药物分子建立氢键结合的精氨酸(Arg)残基；在通道另一侧的523位，COX-1是异亮氨酸(Ile)残基，COX-2则为缬氨酸(Val)残基。由于缬氨酸的分子小于异亮氨酸，因而在其旁边留下一点空隙，称为侧袋，具有某种特殊结构的药物分子可与之结合。在通道开口处的513位，COX-1为组氨酸，COX-2是柔性更好的精氨酸[12](见图2)。

图2 COX-1、COX-2蛋白结构上的差异

以上了解了COX-1/2蛋白结构的差异，正是由于COX-2蛋白侧袋的出现，为COX-2选择性抑制剂的发现提供可能。可以通过分子对接的手段，模拟抑制剂与蛋白间的作用，分析出它们的最佳结合模式及关键作用力，发现疗效更好、毒副作用更低的COX酶抑制剂。

1.3 实验内容

使用Discovery Studio 2016软件中的CDOCKER，分别完成氟比洛芬、塞来昔布同COX-1(PDB：3N8Z)[13]、COX-2(PDB：1CX2)[14]的对接任务，分析其相互作用结合模式。

(1) 实验流程。分子对接主要运用Discovery Studio软件中的CDOCKER模块来完成，包括：蛋白准备、配体小分子准备和分子对接，具体操作流程如图3所示。

(2) 蛋白活性位点定义。蛋白结合位点的确定对于分子对接结果准确性的影响很大，因为配体分子与受体相互作用过程的模拟主要是参考结合位点的几何特征进行的。

产生结合位点的方法：① 以原配体的位置为中心产生结合位点；② 参考文献，以活性口袋周围的关键残基为中心产生结合位点；③ 根据活性口袋特征探测活性位点。

而在本次对接中，使用第①种方法产生结合位点，以PDB：3 N8Z中氟比洛芬所在区域定义为活性位点。

(3) 对接结果分析。完成分子对接后，要从两方面去分析结果，① 要看打分函数(scoring function)，负责评估结合亲和性以及配体位置摆放的合理性[15]，-CDOCKER Energy，它的绝对值越大越好，但打分值不是判断结合好坏的唯一标准；② 还应关注每个配体构象在蛋白中的空间位置、取向及同蛋白的相互作用力。

图3 分子对接实验操作流程

1.4 实验结果

COX-1抑制剂氟比洛芬产生的10个构象中，第1个构象打分值最高，并且氟比洛芬中的羧基与Arg120形成盐桥，与Tyr355形成氢键作用力，远端的芳环与Gly526、Ala527形成范德华力，与Tyr385产生Pi-Pi作用力，使分子稳定存在蛋白中。而它的第2个构象因为羧基位置的改变，丧失了同Arg120和Tyr355的作用力，因此第1构象是最优构象，正是在这样的构象下，发挥活性来抑制COX酶[见图4(a)]。

COX-2抑制剂塞来昔布的对接结果[见图4(b)]。分析可得：塞来昔布中甲苯基位于Phe381、Leu384、Tyr385、Trp387、Phe513和Ser530形成的疏水口袋中；三氟甲基位于Met113、Val116、Val349、Tyr355等形成的口袋中。而塞来昔布具有COX-2选择性是因为苯磺酰胺基团的存在，它好伸入COX-2蛋白的侧袋中，使得磺胺基团中的1个氧原子与Arg513形成氢键，另1个氧原子与His90形成氢键，而氮原子与Phe518形成氢键作用力。

因此，COX-2蛋白侧袋的存在，是发现COX-2抑制剂的关键所在。

2 教学讨论

在以往的药物化学实验中，均为基础性合成实验，从未涉及到计算机辅助药物设计的内容，实验内容较为单一。而首次在实验教学中引入分子对接，一方面丰富了药物化学实验内容，使实验不单单涉及化合物的合成，还涉及到药物靶点发现及虚拟验证，学生能清楚地理解如何通过蛋白结构的不同设计出选择性抑制剂，从而强化靶点在药物设计中的重要性；另一方面，分子对接技术是对药物化学理论课知识体系的延伸，学生能更好地理解药物发现的全过程，是对学生综合能力的培养，创新能力的提升。

在本实验项目中，学生课下查阅文献了解COX酶及亚型结构特征，观看教师提前录制好的对接视频，对分子对接软件界面、操作步骤有大体了解，在通过课上操作演示，让学生掌握分子对接软件使用，直观地理解小分子药物是如何与受体大分子进行识别并发挥作用。

在实验实施过程中，有以下问题：① 课时受限，学生对计算机辅助药物设计、相关软件比较陌生，在刚开始接触的时候，学得比较吃力；② 在进行演示操作流程时，学生能听明白，但自行上机完成对接内容时，却无从下手，不知该如何进行参数设置。因此，在以后的实施中，可提前将计算机辅助药物设计的基础内容和软件内容介绍录制成微视频，发放到学习通上，让学生提前预习。课上，通过实时屏幕共享，学生紧跟每一步操作。课后，开放智慧教室平台，学生通过预约，进入智慧教室自行完成对接任务，真正做到懂操作、会操作。

3 结 语

分子对接技术的引入作为药物化学实验内容改革的首次尝试，是为了让学生理解并树立“结构决定性质，性质决定功能” 的观念，更是为了让实验与科研接轨，通过了解熟悉新技术，激发学生的学习的热情，为日后的科研工作打下坚实的基础。教师唯有不断地学习新知识、新技术，不断地创新改革，才能真正培养出具有创新意识、团队意识的高素质药学人才。