核酸适配体荧光分子开关的啶虫脒测定

杨丽敏, 李明明

(中国石油大学(华东) 化学工程学院，山东 青岛 266580)

0 引 言

近年来，食品安全、环境监测、重大疾病早期诊断等问题日益突出。这些问题是民生，也是政治，关乎社会和谐、国家稳定，更在十三五时期上升为国家重大战略。为此，现代分析化学的任务已不只限于测定物质的组成及含量，而是需要融合科学前沿，以新的思路、观念和方式改进目前的分析检测水平。

核酸适配体(简称，适配体)作为一种人工合成的识别分子，具有高特异性、高亲和性、便于化学修饰与功能化、易于大规模低成本合成等特点[1-3]。无机离子、有机分子、蛋白质乃至细胞、微生物均可能存在与其对应的适配体。因此，基于适配体的传感检测方法已在食品安全、临床医疗、环境监测等领域得到广泛应用，成为分析化学领域的研究热点之一[4-5]。将适配体前沿学术知识理论和实验融入分析化学理论教学和实验教学中，有助于推动分析化学教学与国家需求相衔接[1,6]。

本文聚焦分析化学的实验教学改革，设计了实验“核酸适配体荧光分子开关测定茶叶中的啶虫脒”。适配体荧光分子开关是适配体荧光传感器最常见的策略，属于无需基底的靶分子非标记模式(即SFALF模式)[7]。此模式下无需将适配体固定在基底上，整个传感过程在均相溶液中完成。传感信号主要来自适配体-靶分子结合过程对体系产生的扰动。不仅操作简单，即使动手能力薄弱的学生依然可以轻松驾驭；而且设计灵活，可以激发学生自主探索的兴趣，有助于创新能力的培养。在靶标分析物的选择上，关注到近年来越显突出的茶叶中的农药残留问题，特别是新烟碱类农药(如啶虫脒、吡虫啉等)超标现象时有发生[8]，不仅成为人体健康不可忽视的隐患，而且对茶叶行业造成巨大的经济损失。因此，本实验以啶虫脒为靶分子，设计适配体荧光分子开关，建立茶叶中啶虫脒定量分析方法，加快我国茶叶行业的转型和升级，保障消费者的健康。

1 实验部分

1.1 试剂和仪器

啶虫脒特异性结合适配体(即ABA)的序列来源于文献[9]。实验所用核酸链均由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，其序列如表1所示。啶虫脒购自Sigma公司，Tris-盐酸缓冲液(1 mol/L，pH7.6)购自阿拉丁试剂公司。实验用水均为Millipore超纯水(电阻率18.2 MΩ·cm)。荧光光谱用Fluoromax-4型荧光光谱仪(法国Horiba Jobin Yvon)测定。

表1 实验中使用的核酸链

1.2 BHQ1-cDNA对FAM-ABA的光淬灭效应测量

取8个干净的5 mL容量瓶，分别加入500 μL浓度为0.1 μmol/L的FAM-ABA，0、50、200、300、400、500、1 000、2 000 μL浓度为0.1 μmol/L的BHQ1-cDNA，再用Tris-盐酸缓冲液定容至5 mL。然后，置于37 °C下反应1 h。最后，以480 nm为激发波长测量系列溶液的荧光光谱。

1.3 啶虫脒的标准曲线

取9个干净的5 mL容量瓶，分别加入500 μL浓度为0.1 μmol/L的FAM-ABA和500 μL浓度为0.1 μmol/L的BHQ1-cDNA，37 °C下反应1 h。再向其中分别加入500 μL不同浓度(0，0.025，0.25，0.5，2.5，5 mg/mL)的啶虫脒溶液(丙酮为溶剂)，并用Tris-盐酸缓冲液定容至5 mL，37 °C下反应1 h。最后，以480 nm为激发波长测量系列溶液的荧光光谱。以发射波长520 nm处的荧光强度为纵坐标，啶虫脒浓度的对数值为横坐标，绘制啶虫脒的标准曲线。

1.4 茶叶中啶虫脒的检测

在啶虫脒测定前，首先根据文献[10]进行了样品制备，具体操作步骤如下。取5 g茶叶放进100 mL沸水中煮4 min，待冷却至室温后，过滤掉茶叶。再将滤液用0.22 μm滤膜过滤器过滤3次，收集清液。取1个干净的5 mL容量瓶，加入500 μL浓度为50 mg/mL的啶虫脒溶液，并用茶叶清液定容至5 mL，获得检测样品。

然后，再取1个干净的5 mL容量瓶，加入500 μL浓度为0.1 μmol/L的FAM-ABA和500 μL浓度为0.1 μmol/L的BHQ1-cDNA，37 °C下反应1 h。再向其中加入500 μL检测样品溶液，并用Tris-盐酸缓冲液定容至5 mL，37 °C下反应1 h后，以480 nm为激发波长测量溶液的荧光光谱。取发射波长520 nm处的荧光强度，代入标准曲线，计算样品中的啶虫脒含量。最后，用测定的啶虫脒含量值除以理论值，计算回收率[11]。

2 结果与分析

2.1 荧光分子开关设计

本实验以“双链-复合物法”构建适配体荧光分子开关[12-13]，其原理如图1所示。将荧光基团FAM标记在啶虫脒适配体ABA的5′端，形成FAM-ABA。将淬灭基团BHQ1标记在适配体互补链cDNA的3′端，形成BHQ1-cDNA。当FAM-ABA与BHQ1-cDNA杂交成双链时，FAM和BHQ1位于双链同一端，彼此靠近。在波长为480 nm的激发光照射下，FAM发射的荧光以非辐射形式转移至BHQ1，即发生荧光共振能量转移(FRET)现象。在荧光光谱上可观察到，FAM-ABA的荧光强度比它单独存在时要低得多，即荧光发生淬灭。若样品中存在靶分子啶虫脒，FAM-ABA倾向于与其靶分子结合，而使双链解离，FAM和BHQ1彼此远离。研究表明，FRET效率与荧光基团-淬灭基团间距离的6次方成反比[14-15]。因此，当啶虫脒存在时，FRET效应减弱甚至消失，FAM-ABA的荧光部分或完全恢复。由此可见，FAM-ABA与BHQ1-cDNA构成的双链结构，因啶虫脒的存在与否，形成荧光信号的关和开。以此构建的适配体荧光分子开关可用于啶虫脒的测定。

图1 适配体荧光分子开关的工作原理

2.2 BHQ1-cDNA对FAM-ABA的荧光淬灭效应

为了验证BHQ1-cDNA对FAM-ABA的荧光淬灭效应，将FAM-ABA(10 nmol/L)先与不同浓度的BHQ1-cDNA杂交后，测量系列溶液的荧光光谱。如图2所示，在420 nm激发波长下，FAM-ABA在520 nm处形成一荧光发射峰。随着BHQ1-cDNA浓度从0逐渐增加到40 nmol/L，520 nm处荧光峰的强度逐渐降低。这说明FAM-ABA与BHQ1-cDNA杂交后，荧光发生淬灭，FRET现象发生。并且，观察到当BHQ1-cDNA浓度为10 nmol/L(即与FAM-ABA浓度相同)时，已有58%的荧光发生淬灭，可以用于啶虫脒测定。

图2 FAM-ABA(10 nmol/L)与不同浓度BHQ1-cDNA作用后，在480 nm激发波长下的荧光光谱

2.3 啶虫脒的标准曲线

为了获得啶虫脒的标准曲线，首先对啶虫脒对杂交双链体系的荧光强度影响进行了探究。将FAM-ABA(10 nmol/L)先与BHQ1-cDNA(10 nmol/L)杂交成双链后，再与浓度分别为0，2.5，25，50，250，和500 μg/mL的啶虫脒反应，最后，测量系列溶液的荧光光谱。如图3所示，随着BHQ1-cDNA浓度从0逐渐增加到500 μg/mL，520 nm处荧光峰的强度逐渐增高。这说明，FRET效应减弱，啶虫脒的存在可以引起FAM-ABA与BHQ1-cDNA的分离。另外，还可以注意到，即使使用500 μg/mL(相当于2.25 mmol/L，远高于核酸的使用浓度10 nmol/L)啶虫脒，依然不能使FAM-ABA的荧光强度完全恢复，推测机理可能同时存在內滤效应[16]。

图3 FAM-ABA及不同浓度啶虫脒作用下杂交双链体系的荧光光谱

然后，取520 nm处荧光强度为纵坐标，啶虫脒浓度的对数值为横坐标，绘制啶虫脒的标准曲线。如图4所示，当啶虫脒浓度在2.5～500 μg/mL时，荧光强度与啶虫脒浓度的对数值呈良好线性相关性。

图4 荧光分子开关测定啶虫脒的标准曲线

2.4 茶叶中啶虫脒检测

按照前述实验操作步骤制备含有啶虫脒的茶叶样品溶液，与杂交双链体系作用后，测定体系荧光光谱。取520 nm处的荧光强度，代入标准曲线，计算样品中的啶虫脒含量为50.46 μg/mL，与理论值接近，回收率计算得100.92%，说明该方法准确可靠，可用于实际样品检测。

3 实验特点

本实验是科研成果反哺基础实验教学的典型案例，具有以下突出特点。

(1) 强调科技前沿与实际问题的结合，增强学生服务国家社会的意识。本实验立足食品安全国家重大战略，聚焦茶叶农药残留超标实际问题，突破传统仪器分析在实际应用中的局限，以茶叶常用农药啶虫脒为靶分子，结合适配体传感检测前沿技术，设计适配体荧光分子开关，建立新型检测方法。本实验始于实际问题，止于实际应用，有助于提高学生利用所学解决实际问题的能力，增强服务社会、热爱国家的情操和意识。

(2) 匹配学生实操基础，助力学生把握科技前沿。本实验所需关键材料为FAM-ABA和BHQ1-cDNA两条核酸链，属于商业化定制材料，极易获得。整个实验过程，除了简单的溶液配制外，不涉及任何工艺复杂的材料制备，非常便于操作，能够与学生薄弱的实操基础相匹配。在实验技能上不设置门槛，重在培养解决问题的能力，以及把握科技前沿的能力。

(3) 强化科研思维，培育创新源动力。本实验流程包括：①荧光分子开关设计；②BHQ1-cDNA对FAM-ABA的荧光淬灭效应；③啶虫脒的标准曲线；④茶叶中啶虫脒的检测。其中，第①步是原理设计，“提出假设”；第②、③步是原理可行性验证，“小心求证”；第④步是应用拓展。这种根据问题构建科学假说、根据假说设计实验合理求证、根据实验结果再调整甚至重构科学假说的教学设计，是科研思维的具体表现，有助于培养学生创新意识。在假设阶段，启迪学生不迷信学术权威，不盲从既有学说，敢于大胆质疑。在求证阶段，要求学生严格求证，唯真唯实。在应用阶段，引导学生融入实际应用情景，以解决实际问题为己任。

4 结 语

本实验将分析化学学科研究热点—适配体荧光分子开关引入本科实验教学，面向国家重大需求，科研思维贯穿教学始终。通过本实验，学生们不仅可以接触到学科前沿，更重要的，在解决实际问题的过程中，科研思维得以塑造，科学视野得以拓展，爱国意识得以加强，创新精神得以唤醒。本实验将推动分析化学突破经典的束缚，与前沿接轨，与国家社会需求紧密衔接。