鸡肠粉代替鱼粉对大泷六线鱼幼鱼消化代谢影响的初步研究

■顾祎鑫 张 立，2 代乾良 王文杰 魏艳超 张 正 韩雨哲 王 伟*

（1.大连海洋大学，辽宁省北方鱼类应用生物学与增养殖重点实验室，辽宁 大连 116023；2.鞍山裕丰饲料有限公司，辽宁 鞍山 114100）

随着水产行业对全球经济的影响力持续扩大，国际市场中水产行业经济效益持续增加，以鱼粉（fish meal，FM）为蛋白源的肉食性鱼类饲料使用量正迅速增长。鱼粉因其适口性好，蛋白质含量高，富含维生素、氨基酸和矿物质，长期作为水产饲料中主要的蛋白质来源。但随着厄尔尼诺现象的发生以及全球人口数量的增长，鱼粉的供应量已经不能满足人们日益增长的需求，我国水产配合饲料使用率仅10%的情况下已经感到鱼粉的稀缺，因此寻求新型优质蛋白源已成为国内外学者在近年来关注的焦点。目前研究表明，家禽副产品粉（poultry by-product meal，PBM）作为新型的蛋白源在大菱鲆（Scophthalmus maximus）、大口黑鲈（Micropterus salmoides）、黑鲷（Acanthoparus schlegelii）以及石斑鱼（Epinephelus coioides）等饲料中均可以一定程度上代替鱼粉。家禽副产品粉是家禽屠宰后的下脚料经提炼油脂粉碎后得到的产品。其中鸡肠粉即属于家禽副产品粉的一种，因其具有可用性、合理的价格和丰富的营养含量而逐渐受到关注。有研究认为添加6%的鸡肠粉可以很好地改善早期断奶仔猪肠胃的健康。但在水产动物饲料中用鸡肠粉代替鱼粉的相关研究还比较少。

大泷六线鱼（Hexgrammos otakii）又名欧式六线鱼，隶属于鮋形目（Scorpaeniformes），六线鱼科（Hexagrammidae）、六线鱼属（Hexgrammos）。为冷温性近海底层岩礁鱼类，在我国主要分布于辽宁、山东和江苏等地，在日本及朝鲜半岛也有分布。鱼肉质鲜美，营养丰富，深受广大消费者喜爱，是中国北方养殖、增殖放流和资源修复的理想种类。目前大泷六线鱼的人工养殖技术日渐成熟，对其环境胁迫、毒理及病害的研究相对较多，而对蛋白质需求的研究则相对较少。文章通过评估肠道消化酶、蛋白质代谢酶活性以及3种调控肝脏脂质代谢相关基因的相对表达量，分析饲料中鸡肠粉代替鱼粉对大泷六线鱼的影响。研究结果可为研制大泷六线鱼的配合饲料，合理开发利用鸡肠粉这一新型蛋白源提供理论参考和数据支持。

1 材料方法

1.1 试验饲料制备

以鱼粉和鸡肠粉为主要蛋白源，鱼油和猪油为主要脂肪源配制成5 组等蛋白等脂的试验饲料。其中鸡肠粉代替饲料中40%鱼粉的比例分别为0、25%、50%、75%、100%。分别标记为A1、A2、A3、A4、A5组，其中A1 为对照组（仅含鱼粉不含鸡肠粉），所有饲料原料过60 目筛，按表1 配方称量配制，混匀后经制粒机制成1.5 mm颗粒，晒干后放于-20 ℃冰箱中保存备用。表2为试验饲料氨基酸成分及含量。

表1 试验饲料配方及营养水平（干物质基础，%）

表2 试验饲料氨基酸组成(干物质基础，%)

1.2 饲养管理

试验所使用的大泷六线鱼幼鱼选自于辽宁省北方鱼类应用生物学与增养殖重点实验室。挑选身体健壮、无疾病的375 条幼鱼[平均初始体重为（1.58±0.06）g]随机分配到15 个150 L 的聚乙烯水槽中（预先进行消毒处理），试验分为5组（A1～A5组），每组3个重复，每个重复25 尾。试验前需用试验饲料驯化约1 周的时间，在为期8周的饲养试验期间，每天进行两次（9：00和16：00）投喂，表观饱食。每天换水1次，换水量在1/3～1/2。水温（17±2）℃、盐度25～31、pH为（7.7±0.5）、溶解氧（6.3±0.5）mg/L、氨氮含量小于0.1 mg/L。

1.3 样品的收集与测定

取样前将试验鱼停食24 h后，用100 mg/L间氨基苯甲酸乙酯甲磺酸盐（ms-222）麻醉鱼体并于冰上进行无菌解剖，每组随机挑选8尾鱼取肠道和肝脏，样品存于-80 ℃冰箱中。每组选取12尾鱼尾部采血，血液在4 ℃条件下4 000 r/min离心10 min，取上清液存于-80 ℃冰箱中。肠道用于消化酶测定，肝脏、血清用于蛋白质代谢酶以及脂质代谢相关基因相对表达量的测定。

肠道胃蛋白酶（Pepsin，PEP）、α-淀粉酶（α-Amylase，α-AMS）、脂肪酶（Lipase，LPS）以及蛋白质代谢相关的谷草转氨酶（Glutamic-oxalacetic transaminase，GOT）和谷丙转氨酶（Glutamic-pyruvic transaminase，GPT）活性测定的试剂盒均购自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.4 实时荧光定量PCR分析

使用Trizol法提取样品肝脏RNA，反转录合成cDNA后于-20 ℃保存备用。根据Primer 5.0软件设计脂质代谢相关基因过氧化物酶增殖激活受体γ（PPARγ）、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶（G6PD）、肉碱棕榈酰转移酶（CPT-1）的特异性引物。引物由上海生工生物工程有限公司合成（见表3），以β-actin为参照基因。

表3 引物信息

荧光定量PCR反应体系为20 μL，上、下游引物各0.6 μL，2×Talent qPCR PreMix 10 μL、cDNA模板1 μL和RNase-Free ddH2O 7.8 μL 加入96 孔板中，离心后放入Roche PCR仪中开始分析。扩增条件为：95 ℃条件下预变性3 min；95 ℃条件下变性5 s，60 ℃条件下退火15 s，进行40个循环。数据采用2-△△Ct法进行分析，取3次重复的平均值。

1.5 数据处理

使用SPSS 19 软件进行单因素方差分析检验，试验数据以“平均值±标准差”表示，采用Duncan’s法进行多重比较分析各处理组间显著性，P＜0.05为显著差异。

2 结果与分析

2.1 鸡肠粉代替鱼粉对大泷六线鱼幼鱼肠道消化酶活性的影响（见表4）

表4 鸡肠粉代替鱼粉对大泷六线鱼幼鱼肠道消化酶活性的影响

由表4可知，随着鸡肠粉代替鱼粉比例提高可以不同程度影响大泷六线鱼幼鱼肠道消化酶的活性，且总体呈现先上升后下降的趋势。其中胃蛋白酶活性在A3（50%）组时达到最大，A2（25%）组时脂肪酶活性显著高于其他组（P＜0.05）。而α-淀粉酶活性随鸡肠粉代替水平的上升总体变化则不大（P＞0.05）。

2.2 鸡肠粉代替鱼粉对大泷六线鱼幼鱼肝脏、血液代谢酶活性的影响（见表5、表6）

表5 鸡肠粉代替鱼粉对大泷六线鱼幼鱼肝脏代谢酶活性的影响（U/g prot.）

表6 鸡肠粉代替鱼粉对大泷六线鱼幼鱼血液代谢酶活性的影响（U/L）

由表5、表6 可知，随着鸡肠粉代替鱼粉的比例增加，大泷六线鱼幼鱼的肝脏及血清中的GOT 和GPT 活性呈上升趋势。其中肝脏中A4（75%）、A5（100%）组GOT 活性显著高于A1（对照）、A2（25%）组，且GPT 活性显著高于其他各组（P＜0.05）。血清中A5（100%）组GOT 活性显著高于其他各组（P＜0.05），而GPT 活性在A4（75%）、A5（100%）组时呈显著上升趋势（P＜0.05）。

2.3 鸡肠粉代替鱼粉对大泷六线鱼幼鱼肝脏脂质代谢相关基因mRNA表达量的影响（见图1～图3）

图1 鸡肠粉代替鱼粉对大泷六线鱼幼鱼PPAR-γ基因相对表达量的影响

图2 鸡肠粉代替鱼粉对大泷六线鱼幼鱼CPT-1基因相对表达量的影响

由 图1～图3 可 知，PPAR-γ与G6PD基 因 的mRNA 表达量和鸡肠粉代替水平成正相关，其中PPAR-γ基 因 的mRNA 表 达 量 在A3（50%）、A4（75%）、A5（100%）组时显著上调（P＜0.05），而G6PD基因的mRNA 表达量在A4（75%）、A5（100%）组时显著上调（P＜0.05）。CPT-1基因的mRNA 表达量和鸡肠粉代替水平呈负相关，在A4（75%）、A5（100%）组时显著下调（P＜0.05）。

图3 鸡肠粉代替鱼粉对大泷六线鱼幼鱼G6PD基因相对表达量的影响

3 讨论

3.1 鸡肠粉代替鱼粉对大泷六线鱼幼鱼肠道消化酶活性的影响

消化酶的活性直接说明了动物对其营养物质消化吸收的能力，是衡量水产动物对饲料适应性的方法之一。研究表明，摄入不同来源的蛋白质可以影响动物消化酶的分泌。本试验结果表明，鸡肠粉代替一定量的鱼粉时可以显著提升胃蛋白酶和脂肪酶的活性，这与黄颡鱼（Pelteobagrus fulvidraco）、鳝（Monopterus albus）、吉富罗非鱼（Oreochromis niloticus，GIFT strain）的研究结果相似。说明鸡肠粉的部分代替鱼粉会提高大泷六线鱼幼鱼对蛋白质的消化，增强了对饲料中蛋白质的利用能力。不过也有一些研究表明，PBM部分代替鱼粉会显著降低大菱鲆胃蛋白酶的活性。PBM缺乏某些必需氨基酸（如蛋氨酸和赖氨酸）同样可能导致一些鱼类对其消化吸收能力降低。而作为衡量动物消化能力的另一个指标淀粉酶可根据水解产物的构型分为α-淀粉酶和β-淀粉酶，α-淀粉酶可以存在于各种极端环境下，常常存在于水产动物的消化系统之中。本试验研究表明，饲料中一定量的鸡肠粉代替鱼粉不会影响肠道中α-淀粉酶的活性。Jalili 等（2012）研究表明，在虹鳟（Oncorhynchus mykiss）饲料中运用PBM代替一定比例的鱼粉同样不会对其肠道中α-淀粉酶的活性产生显著的影响。有研究表明，PBM 代替75%的鱼粉时会显著降低大口黑鲈肠道中α-淀粉酶的活性。除了必需氨基酸的缺乏之外，PBM质量的高低，不同鱼种的营养需求，饲料配方差异的存在都可能影响鱼类对PBM消化吸收的能力。

3.2 鸡肠粉代替鱼粉对大泷六线鱼幼鱼血清、肝脏蛋白质代谢酶活性的影响

作为两种重要的转氨酶，GOT与GPT主要存在于肝脏和血液之中，是评价肝脏功能代谢健康最重要的指标之一。GOT 与GPT 活性的高低反映出了鱼类蛋白质代谢的状态。近年来研究表明，在鱼类饲料中添加不同种类的PBM 代替鱼粉对水产动物肝脏、血液GOT 与GPT 的活性产生不同的影响。本试验研究表明，随着饲料中鸡肠粉代替鱼粉的比例增加会增加肝脏和血液中GPT与GOT的活性，当代替比例＞75%时，GOT 与GPT 均显著提高。肝脏中这两种转氨酶的活性较低，肝脏受到损伤时转氨酶进入血液导致活性增高，本试验结果说明鸡肠粉高比例代替鱼可能会导致大泷六线鱼幼鱼肝脏发生损伤。Robaina等（1997）研究发现，在饲料中PBM代替鱼粉比例超过40%时GOT与GPT的活性显著增强，说明饲料中一定比例的PBM代替同样导致了大菱鲆肝脏发生损坏，与本试验结果类似。而另外一些研究表明，PBM代替60%的鱼粉不会对黑鲷血液中GOT 与GPT 的活性产生显著的变化。结果的差异可能是由于不同鱼种生存环境、营养需求以及对PBM 的耐受性有关。因此，在PBM 代替鱼粉的同时，添加一些有助于肝脏健康的添加剂成为学者们关注的焦点。

3.3 鸡肠粉代替鱼粉对大泷六线鱼幼鱼肝脏脂质代谢相关基因mRNA表达量的影响

饲料中氨基酸种类分为必需氨基酸和非必需氨基酸，作为必需氨基酸种类之一，蛋氨酸是机体代谢的甲基供体，对调节肝脏脂肪代谢起到重要的作用。研究表明，在草鱼（Catenopharyngodon idella）饲料中添加蛋氨酸可使其肝胰脏脂质含量降低26%～74%。因此，在饲料中添加蛋氨酸对鱼类的脂质代谢能力具有显著的提高。然而，PBM相比鱼粉，缺乏一些如赖氨酸、蛋氨酸等必需氨基酸，因此缺乏蛋氨酸的鸡肠粉在代替一定比例的鱼粉时很可能造成鱼体内脂肪酸的堆积。近年来，脂质代谢在不同EPA/DHA比例、蛋白质水平以及脂肪酸添加剂等方面都有大量的研究，但在不同饲料蛋白源导致氨基酸不平衡的相关研究甚少。在本试验中，在大泷六线鱼幼鱼饲料中鸡肠粉代替一定比例鱼粉可能会导致饲料中蛋氨酸的不平衡，从而表现为调控肝脏脂质代谢基因mRNA表达量相应发生变化。

过氧化物酶增殖物激活受体（PPAR）在动物肝脏内存在大量表达。作为PPAR的下游基因，CPT-1是脂肪酸β氧化的限速酶，参与脂肪酸线粒体氧化，PPAR/CPT-1组成的信号通路共同调节动物肝脏内的脂质代谢。研究表明，通过调节CPT-1信号通路，可以改善大鼠肝脏代谢，减轻肝脏损伤。本试验发现，饲料中鸡肠粉代替鱼粉＞75%时使得CPT-1基因的mRNA 显著下调。杨玉辉等（2019）发现蛋氨酸的限制使肥胖小鼠CPT-1基因显著下调，蛋氨酸水平减少可降低肉鸡肝脏中CPT-1mRNA表达量，上述结果均与本试验的研究结果相似。PPAR-γ与G6PD均为参与脂肪酸合成的关键酶。作为PPAR的一种亚型，PPAR-γ是脂肪代谢相关的转录因子之一，直接参与脂肪代谢过程。当转录调控因子的基因表达发生障碍，会引起肝脏中脂代谢的紊乱，导致脂肪肝的发生。本研究表明，鸡肠粉代替鱼粉＞50%时PPAR-γ基因的mRNA基因表达量显著上调，说明高比例的鸡肠粉代替鱼粉导致蛋氨酸的缺失，从而造成大泷六线鱼幼鱼肝脏脂肪酸堆积。张庆功等（2019）发现饲料中低水平蛋氨酸使得红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）肝脏中PPAR-γ基因的mRNA 显著上调，与本试验研究结果类似。肝脏中G6PD主要存在于动物胞质内，其活性的变化与肝脏脂肪酸合成的速度息息相关。其脂肪酸的合成提供了还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH），作为供氢体维持谷胱甘肽（GSH）还原性，NAPDH用于脂肪酸和胆固醇的合成。本试验研究表明，G6PDmRNA 表达量随着鸡肠粉代替鱼粉比例的增大总体呈现上升的趋势，在代替比例＞75%时显著上调，G6PD高表达合成了更多NAPDH，导致脂肪酸的累积。不过也有研究表明，G6PD表达量相对过低也可能造成肝脏DNA 损伤、细胞凋亡率增高。由此看来，抑制脂肪酸氧化能力和脂质合成能力的提高是引起其肝脏内脂质代谢能力下降的主要原因。在大泷六线鱼饲料中鸡肠粉代替鱼粉不高于50%时，CPT-1、PPAR-γ、G6PDmRNA 表达量都不会发生显著的变化。因此，在饲料中鸡肠粉代替鱼粉的基础上，添加适量的蛋氨酸等必需氨基酸对减少大泷六线鱼幼鱼肝脏脂肪的沉积会有很大的帮助，相关内容有待进一步深入研究。

4 结论

综上所述，在大泷六线鱼幼鱼饲料中，鸡肠粉代替鱼粉＜50%时，对其肠道消化酶、蛋白质代谢酶以及肝脏脂质代谢均无不良影响。因此建议大泷六线鱼幼鱼饲料中鸡肠粉的适宜添加量为50%。