阿魏酸对镉致小鼠急性肝损伤的保护作用

■徐诗雨 唐子婷 孙雅荻 李 娜 蒋岳岑 余子康 林居纯 舒 刚

（四川农业大学动物医学院，四川 成都 611130）

镉（Cd）是环境中常见的重金属污染物，作为重要的工业原料，其使用量和释放量不断增加，环境分布也不断扩大。水体和土壤中的镉元素极易被农作物吸收富集，通过食物链的形式进入人体，在肝脏、肾脏、肺脏和骨骼等组织器官中蓄积[1]，危害人体健康。镉吸收进入血液循环后可快速到达肝脏，在肝脏中进行蓄积。有研究发现，小鼠经染镉后肝脏体积增大，肝叶肿胀明显，肝叶间有粘连，边缘变钝，颜色紫黑，质地变硬，表明镉对小鼠肝脏损伤极为严重[2]。近年来，镉中毒治疗多使用螯合剂，而镉与螯合剂会形成亲脂性较大的螯合物，致使镉在脑组织重新分布，产生严重的副作用[3]。而中药防治镉中毒具有时间短、效果好和毒副作用小等特点，是防治镉中毒的理想药物来源，其开发潜力巨大，具有较好的应用前景[4]。

阿魏酸（Ferulic acid，FA）化学名称为4-羟基-3-甲氧基肉桂酸，是桂皮酸（又称肉桂酸，3-苯基-2-丙烯酸）的衍生物之一，分子式为C10H10O4。阿魏酸的氧化性强，不仅能抑制产生自由基的酶，还可增加消除自由基酶的活性[5]。除此之外，阿魏酸还具有抗癌、抗血栓、抗菌、抗病毒等药理作用，在临床上主要用于防治冠心病、脑梗死和肝脏疾病等。近年来的研究表明，阿魏酸能通过不同机制达到保护肝脏的作用。郭玲等[6]的研究中证明，阿魏酸能通过抑制转化生长因子-β1（TGF-β1）诱导肝细胞Smad-3表达，促进MMP-2、MMP-9表达，减少肝细胞凋亡，并促进肝细胞增殖，减轻肝纤维化；钟正灵等[7]的研究中显示，阿魏酸对急性肝损伤具有一定的保护作用，其机制可能与抗氧化作用有关；阿魏酸还可以通过清除肝脏中的自由基和活性氧来保护肝细胞器和酶结构等，Zhang等[8]试验证明，阿魏酸可以有效清除过氧化氢、过氧化亚硝基、羟自由基、超氧自由基。何洋[9]的研究中发现，阿魏酸能通过抑制关键CYP450酶，如CYP1A2、CYP2E1、CYP2A6和CYP3A4蛋白的表达，抑制环氧化物AFBO 的生成，从而减少活性氧（ROS）含量，缓解肝细胞受到的氧化应激损伤。

目前，阿魏酸与缓解小鼠重金属中毒引发的肝脏损伤的相关研究较少。阿魏酸可以缓解铁过载引起的脂质过氧化作用[10]，在李海玲等[11]的试验证明了阿魏酸清除自由基和活性氧的能力，试验结果显示阿魏酸钠与牛磺酸均可清除铁过载小鼠肝脏中的氧自由基使脂质过氧化产物减少，达到稳定细胞膜的作用，这为本研究选用阿魏酸来颉颃镉致小鼠的急性肝损伤的可能性提供了参考。本研究以SPF级（无特定病原体）昆明小鼠为研究对象，初步研究不同浓度的阿魏酸对镉致小鼠急性肝损伤的保护作用，以期为阿魏酸在缓解畜禽镉中毒解救中的应用提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

80只SPF级雄性小鼠（9周龄），体质量（20±2）g，由成都达硕实验动物中心提供[动物许可证号：SYXK（川）2014-189]，试验地点为四川农业大学动物医学院药学系实验室及动物房。

阿魏酸（购自成都瑞芬思生物科技有限公司，生产批号：RFS-A00211812016）、氯化镉（CdCl2分析纯，购自成都市科隆化学品有限公司，生产批号：201803820）、4%多聚甲醛固定液（购自Beyotime 公司，生产批号：P0099-500 mL）、氯化钠（NaCl分析纯，购自成都市科隆化学品有限公司，生产批号：2020102801）、纯化水；门冬氨酸氨基转移酶（AST）试剂盒（生产批号：20200612）、丙氨酸氨基转移酶（ALT）试剂盒（生产批号：20200503）、丙二醛（MDA）试剂盒（生产批号：20210827）、超氧化物歧化酶（SOD）试剂盒（生产批号：20201208）、总抗氧化能力（T-AOC）试剂盒（生产批号：20210830）、还原型谷胱甘肽（GSH）试剂盒（生产批号：20200910），均购自南京建成生物工程研究所有限公司。

1.2 仪器与设备

FC 型酶标仪（美国Thermo 公司）、高速冷冻离心机（美国Thermo公司）、电子恒温水浴锅（北京中兴伟业仪器有限公司）、RM2245 型转轮式切片机（美国Thermo 公司）、BC-3000plus 全自动动物血液分析仪（深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司）、BI-2000 医学图像分析系统（成都泰盟科技有限公司）。

1.3 试验方法

1.3.1 试验分组及给药

将80只SPF级雄性小鼠适应性喂养5 d后随机分为5 个组，每组16 只，分别为空白组、模型组、低剂量阿魏酸组、中剂量阿魏酸组、高剂量阿魏酸组。低、中、高剂量阿魏酸组分别灌胃低、中、高剂量（75、150、300 mg/kg）阿魏酸，空白组和模型组灌胃同等给药量的生理盐水，每天1次，处理14 d。小鼠饲喂于四川农业大学动物医学院动物房，室温（22±1）℃，相对湿度50%～60%，12 h/12 h明暗节律，自由进食、饮水。在第15天时按照0.2 mL/10 g（体重）灌服氯化镉溶液（167.3 mg/kg），观察24 h内小鼠死亡情况并记录死亡时间。

1.3.2 样品采集

试验第15天，摘小鼠眼球取血，放于1.5 mL离心管中于室温下静置1～2 h，然后4 ℃条件下4 000 r/min离心5 min 分离血清。采用颈椎脱臼法处死小鼠，开腹，取出肝脏。切大约0.5 g肝右叶制备肝匀浆，取大约0.3 g肝脏用预冷生理盐水按1∶9(m/V）配制成10%组织匀浆液，取大约0.2 g 肝脏用预冷生理盐水按1∶4（m/V）配制成20%组织匀浆液，以备后续试验。

1.4 指标检测

1.4.1 肝脏指数测定

去除肝脏结缔组织，使用生理盐水清洗肝脏数次，用滤纸拭干后称重，计算肝脏指数。

肝脏指数（%）=肝脏重量（g）/小鼠体重（g）×100[12]

1.4.2 血液白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）含量和血细胞比容（HCT）测定

采用摘眼球法收集的小鼠血液0.2～0.4 mL，置于1.5 mL 抗凝血管中，上下轻柔转动使其充分抗凝，混匀后采用BC-3000plus 全自动动物血液分析仪检测抗凝血中的白细胞（WBC）、红细胞（RBC）、血红蛋白（HGB）含量和血细胞比容（HCT）4项生理指标。

1.4.3 血清酶活性测定

将分离的血清，按照南京建成生物工程研究所有限公司提供的试剂盒说明书测定小鼠血清ALT 与AST的活性。

1.4.4 肝组织GSH、SOD活性以及MDA、T-AOC 含量测定

将10%的肝脏组织匀浆分别以2 500、3 000、3 500 r/min的转速各离心10 min，收集上清液用于测定组织匀浆中的SOD、GSH活性和MDA含量；将20%的肝脏组织匀浆以12 000 r/min的转速离心5 min，收集上清液测定T-AOC，后续操作严格按照试剂盒说明书操作。

1.4.5 肝脏组织病理学检查

摘取小鼠肝脏病变部分，经4%多聚甲醛固定，用乙醇脱水，石蜡包埋，脱模并切片，苏木精-伊红（H.E.）染色，采用BI-2000医学图像分析系统进行拍照以及图像分析，观察肝脏组织病理学变化（×200）。

1.5 数据统计分析

使用SPSS 23.0 软件进行统计学分析，数据结果均以“平均值±标准差”表示，多组均数间比较采取单因素分析，多重比较采用LSD 检验，P＜0.05 表示显著差异，P＞0.05表示差异不显著。

2 结果与分析

2.1 阿魏酸对小鼠肝脏指数的影响（见表1）

表1 阿魏酸对小鼠肝脏指数的影响

与空白组相比，模型组小鼠的肝脏指数明显增加（P＜0.05），结合实际观察，肝脏有明显肿大和发炎的病变情况。与模型组相比，经阿魏酸处理后，肝脏指数明显减小（P＜0.05），表明阿魏酸对镉致急性肝损伤有一定的保护作用。

2.2 阿魏酸对小鼠血液中生理指标的影响（见表2）

由表2可知，与模型组相比，经阿魏酸处理后，血液中WBC、RBC、HGB 含量和HCT 略有升高，高剂量阿魏酸组WBC和RBC含量与模型组相比具有显著性差异（P＜0.05）。

表2 阿魏酸对小鼠血液中WBC、RBC、HGB及HCT的影响

2.3 阿魏酸对小鼠血清酶活性的影响（见表3）

从表3 结果可知，与空白组比较，模型组的AST和ALT 活性显著升高（P＜0.05）。与模型组比较，经阿魏酸处理后，低、中、高剂量阿魏酸组都可阻止小鼠因镉引起的血清ALT、AST 活性升高，具有统计学差异（P＜0.05）。

表3 阿魏酸对小鼠血清中AST、ALT活性的影响（U/L）

2.4 阿魏酸对小鼠肝组织抗氧化能力的影响（见表4）

表4 阿魏酸对小鼠肝组织中GSH、SOD、MDA、T-AOC水平的影响

与空白组相比，模型组的MDA含量显著升高（P＜0.05）；T-AOC 含量、GSH 和SOD 活性呈显著下降（P＜0.05），说明镉使模型组小鼠肝细胞出现氧化损伤，机体内氧化平衡失调，证明急性肝脏损伤模型建造成功。

与模型组相比，阿魏酸能降低肝脏MDA含量，但只有高剂量阿魏酸组具有显著差异（P＜0.05）；中高剂量阿魏酸组小鼠肝组织中SOD、GSH 活性和T-AOC含量显著升高（P＜0.05），低剂量组小鼠SOD活性呈升高趋势（P＞0.05），T-AOC 含量和GSH 活性具有升高趋势，但不具统计学差异，也能说明阿魏酸在一定程度上可恢复肝脏抗氧化酶的活性。

2.5 阿魏酸对小鼠肝脏组织结构的影响（见图1）

空白组（图1A）小鼠肝组织结构完好，肝索排布规整，肝小叶轮廓清晰，细胞核染色较深，圆形居中；模型组（图1B）小鼠血管扩张，肝血窦扩张严重、肝脏充血、肝细胞间有淋巴细胞浸润，肝细胞凋亡。经阿魏酸处理后，低剂量阿魏酸组（图1C）小鼠肝细胞间淋巴细胞和中性粒细胞浸润，肝细胞有嗜酸性样变，血管内皮增生，肝血窦仍扩张；中剂量阿魏酸组（图1D）小鼠汇管区可见淋巴细胞浸润；并伴有肝细胞水肿；高剂量阿魏酸组（图1E）小鼠有少量肝细胞水肿，但其他病变并不明显。

图1 各组小鼠肝脏组织切片（H.E.染色，×200）

3 讨论

3.1 阿魏酸对小鼠肝脏指数的影响

脏器系数的变化可反映受试动物脏器的毒性情况，也是寻找毒物靶器官的重要线索[13]。模型组肝脏的脏器系数显著高于空白组，说明镉染毒可对肝脏产生影响，推测这种影响可能是镉引起肝细胞水肿和坏死性病变，进而可眼观发现肝脏肿大或发炎等病变情况，引起肝脏重量上升；阿魏酸处理后，脏器系数显著降低，其原因推测为阿魏酸与重金属镉颉颃，降低肝脏的中毒反应。肝是机体中重要的解毒器官，任何药物或毒物进入体内后都要在其中进行代谢，肝脏脏器系数的升高可能是器官损伤的一种代谢补偿效应[14]。说明阿魏酸在一定程度上具有减轻由镉引起的肝脏损伤的作用。

3.2 阿魏酸对小鼠血液生理指标的影响

阿魏酸能够抑制与某些细菌、病毒生存相关酶的活性。吴大正等[15]发现，阿魏酸钠能够减轻由炎症介质组胺引起的大鼠脑表面跨毛细血管电阻下降，说明其对组胺造成的脑毛细血管通透性增加具有改善作用，而降低脑毛细血管通透性能够促进炎症的改善。有研究表明，镉暴露会抑制机体免疫，降低白细胞计数[16]。这一结论在本试验中得以证实，模型组小鼠血液中白细胞数量较空白组显著减少，表示机体患有轻微炎症，推测这种现象是由于氯化镉导致小鼠发生急性感染，抑制了机体的免疫功能；经阿魏酸处理后，低、中、高3个剂量组小鼠白细胞数量均有回升，其中高剂量阿魏酸组小鼠白细胞总数升高显著，表明高浓度的阿魏酸能增强免疫抑制小鼠的免疫功能，提高机体的免疫力，巩固机体的防御系统，在一定程度上证实阿魏酸具有抗菌消炎的药理作用。红细胞的功能以运输氧气为主，同时也与机体免疫相关，红细胞具有强大的免疫黏附作用，能够识别携带抗原，清除机体循环中免疫复合物，并参与免疫功能调节。杨大千[17]研究表明，氯化汞溶液可导致小鼠产生再生障碍性贫血。此结论与本试验中结果一致，模型组小鼠红细胞总数显著降低，经阿魏酸处理后，小鼠血液中红细胞数目均呈显著上升趋势，推测同白细胞类似，是由于阿魏酸增强机体防御屏障功能，提高了小鼠的免疫力所致。

3.3 阿魏酸对小鼠血清酶和肝组织抗氧化活性的影响

AST、ALT是肝细胞内酶，两者在氨基酸的合成与分解代谢中起重要作用。当肝组织受到急性损伤，AST、ALT大量释放进入血液中，导致血液中AST活性和ALT活性增加，因此可作为评价肝细胞坏死的重要指征[18]。在本试验中，模型组AST、ALT活性较空白组显著升高，表明模型组肝脏损伤后引起了细胞膜坏死并可能使细胞膜通透性增加，ALT 和AST 溢出肝细胞，由此导致血清ALT、AST 活性升高。经阿魏酸处理后，血清ALT、AST 活性明显降低且各剂量组都具有统计学意义，肝脏损伤明显减轻，此结果表明阿魏酸能显著降低血清中升高的ALT、AST 活性，从而达到保护肝脏细胞膜的作用。

阿魏酸是一种天然活性物质，同时也是一种强抗氧化剂，能够清除机体内过量活性氧（ROS）达到抗氧化损伤、抵抗脂质过氧化作用，或直接清除自由基或产生自由基的酶。这一观点在Zdun’ska等[19]的研究中体现，试验结果表明阿魏酸的作用机制是能大大增加谷胱甘肽转移酶和醌还原酶的活性，抑制酪氨酸酶活性。阿魏酸的酚羟基是具有这种清除活性的功能基团。黄华永等[20]证实，阿魏酸及类似物清除自由基活性的强弱与其结构中酚羟基的邻位取代基有较大的相关性。阿魏酸亦能与膜磷脂酰乙醇胺结合，保护膜脂质不被自由基侵袭，从而发挥抗脂质过氧化作用[21]。夏雪芬等[22]的试验表明，阿魏酸糖酯对活性氧诱导剂（AAPH）诱导的大鼠氧化损伤起到较好的保护作用，经过证实其可以激活Nrf2抗氧化信号通路，刺激Nrf2/Keap1-ARE抗氧化信号通路下游的相关抗氧化酶的表达。

而镉摄入过量可在机体包括肝脏等多种组织器官中沉积，其毒性作用可能是蓄积在肝中的镉会使肝细胞膜发生脂质过氧化反应，诱导机体产生大量自由基，进一步加重膜结构的破坏，从而加重镉对肝组织的损害[23]。SOD是机体代谢活性氧游离基的主要酶[24]，可以清除机体代谢过程中产生过量的超氧阴离子自由基，是衡量机体抗氧化能力的重要指标。MDA 是自由基作用于脂质发生过氧化反应过程中产生的最终产物，MDA 含量升高是肝损伤的一个重要标志。本次研究发现，镉可使急性肝损伤小鼠肝匀浆脂质过氧化产物MDA 含量显著增加，同时明显降低抗氧化物SOD、GSH 活性，使机体总抗氧化能力显著下降；T-AOC 含量的降低说明模型组小鼠体内氧化还原平衡受到破坏，其余3个指标则说明了镉引起急性肝损伤的机制与脂质过氧化有关。与模型组相比，不同剂量的阿魏酸可以不同程度地减轻由镉引起的抗氧化酶活性的变化，高剂量阿魏酸能显著升高肝组织中SOD、GSH 活性和T-AOC 含量，降低升高的MDA 含量，其机制可能与阿魏酸能颉颃机体的氧化压力，改变部分体内抗氧化酶系统的氧化环境与抗氧化能力相关[25]。阿魏酸可减弱由自由基诱发的机体内脂质过氧化作用，恢复细胞膜系统损伤及其功能[26]。康旭珍[27]的研究表明，阿魏酸可有效地抑制由二价铁离子诱导的兔肝微粒体脂质过氧化，在肝脏微粒体脂质过氧化的测定体系中，可以抑制脂质过氧化产物MDA的生成，这与本试验显示结果一致。虽然低剂量组的SOD 活性与MDA 含量、中剂量组的MDA 含量与模型组差异不显著，但在一定程度上也反映了阿魏酸具有颉颃镉导致的肝脏氧化损伤作用。

3.4 阿魏酸对小鼠肝脏组织结构的影响

肝脏组织结构的破坏是肝脏受损的直观病理表现。有研究表明，给小鼠给予镉处理后，小鼠肝脏细胞肿胀，有严重的肝脏炎症和肝细胞凋亡[28]。在李变丽等[29]的试验中发现，经镉染毒后，小鼠的肝脏出现肝细胞排列松散、胞浆内充满小空泡、炎性细胞浸润及肝细胞出血等现象。在本试验结果中，模型组可观察到肝细胞排列松散，肝细胞间有淋巴细胞浸润，肝血窦扩张严重及肝细胞凋亡现象。与前人试验结果基本一致，即显示镉对小鼠能造成急性肝损伤。经阿魏酸处理后，各剂量小鼠并未再次观察到有肝细胞凋亡现象发生，这与郭玲等[6]的研究成果一致。阿魏酸能减轻病变肝脏内肝血窦的扩张程度，减少淋巴细胞浸润，明显改善肝损伤，肝细胞死亡减少，且高剂量阿魏酸效果更加明显。阿魏酸作为一种强抗氧化剂，可以清除活性氧，改善机体脂质过氧化，通过这种抗氧化作用，阿魏酸可抑制肝脏内的细胞凋亡，类似的结论在康冠楠等[30]的研究中有所报道。因此推测阿魏酸对抗镉的肝毒性可能是由于其抗氧化作用。提示阿魏酸将有潜力成为高效、安全的颉颃镉致小鼠肝脏损伤的药物。

4 结论

本试验研究表明，阿魏酸能够有效改善由镉导致的小鼠急性肝损伤，提高肝脏的抗氧化能力，保护肝脏细胞膜，减轻由镉引起的肝脏病变，当阿魏酸剂量为300 mg/kg处理小鼠时，可最大程度降低其体内脂质过氧化，保护肝脏不受损伤，机体的抗氧化功能最强。