miR-519a-3p通过靶向GALNT4基因调控肺癌细胞迁移、侵袭和凋亡的分子机制

梁青松 贾军 胡欣

肺癌临床治疗效果不佳，易复发和转移[1]。肺癌细胞迁移和侵袭是肺癌复发和转移的主要原因[2]，探讨影响其迁移和侵袭的分子机制对预后改善具有重要意义。miR-519a是一种微小RNA(miRNA)，有报道称其在非小细胞肺癌组织中表达降低[3]，然而，其对肺癌细胞恶性表型的影响及机制还未知。Starbase生物信息学软件预测显示，多肽-N-乙酰氨基半乳糖转移酶4(GALNT4)可能是miR-519a-3p的靶基因。GALNT4是N-乙酰氨基半乳糖转移酶的多肽家族成员，是催化O-聚糖合成的关键酶。研究显示，GALNT4在前列腺癌[4]、结肠癌[5]等肿瘤细胞中表达升高，促进肿瘤细胞的恶性表达，发挥促癌基因作用。本研究以miR-519a-3p/GALNT4轴为切入点，探讨影响肺癌发生发展的分子机制，以期为肺癌治疗提供新靶点。

1 材料与方法

1.1 实验材料 正常肺上皮细胞BEAS-2B及肺癌细胞系NCI-H1299、NCI-H2170和PNCI-H1975，中国科学院上海细胞库；胎牛血清(FBS)，美国Hycolne公司；RPMI 1640培养基、Annexin V-FITC/PI细胞凋亡试剂盒、二喹啉甲酸(BCA)蛋白检测试剂盒及双荧光素酶活性检测试剂盒，北京索莱宝；LipofectamineTM 2000试剂盒，美国Invitrogen公司；RNA抽提试剂盒、逆转录试剂盒和PCR试剂盒，大连宝生物；GALNT4抗体，上海钰博生物科技有限公司；兔抗人基质金属蛋白酶2(MMP-2)、基质金属蛋白酶9(MMP-9)和活化的半胱天冬酶-3(Cleaved-caspase-3)单克隆抗体，美国Santa Cruz公司；兔抗人磷脂酞肌醇3-激酶(PI3K)和蛋白激酶B(AKT)磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化AKT(p-AKT)单克隆抗体，北京中杉金桥生物试剂公司；PCR引物、miR-519a-3p mimcs、miR-NC、si-GALNT4、si-NC、anti-miR-519a-3p及anti-miR-NC、pcDNA-GALNT4及pcDNA，上海吉玛制药技术有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养:复苏正常肺上皮细胞BEAS-2B及肺癌细胞系NCI-H1299、NCI-H2170和PNCI-H1975，均用含10% FBS的RPMI 1640培养基培养。细胞融合至80%左右时，0.25%胰蛋白酶消化，以1∶3比例传代培养。将对数期BEAS-2B、NCI-H1299、NCI-H2170和PNCI-H1975细胞均接种于6孔板中(1.0×105个/孔)，培养24 h后，收集细胞，RT-qPCR检测细胞中miR-519a-3p和GALNT4 mRNA表达。

1.2.2 细胞分组转染:将对数期NCI-H1299细胞接种于6孔板中(1.0×105个/孔)，利用Lipofectamine 2000试剂盒，分别转染miR-519a-3p mimcs(miR-519a-3p组)、miR-NC(miR-NC组)、anti-miR-519a-3p(anti-miR-519a-3p组)、anti-miR-NC(anti-miR-NC组)、si-GALNT4(si-GALNT4组)、si-NC(si-NC组)、共转染miR-519a-3p mimcs及pcDNA-GALNT4(miR-519a-3p+pcDNA-GALNT4组)、miR-519a-3p mimcs与pcDNA(miR-519a-3p+pcDNA组)。RT-qPCR法检测细胞中miR-519a-3p表达或Western Blot法检测GALNT4表达验证转染效果。

1.2.3 RT-qPCR检测细胞中miR-519a-3p和GALNT4 mRNA表达:利用RNA抽提试剂盒提取细胞中总RNA，经逆转录后，行PCR扩增。反应条件：95℃5 min；95℃ 15 s，60℃ 30 s，72℃ 30 s，共35个循环。引物序列：miR-519a-3p正向5’-GTCCGATAGGTGGCT

AGT-3’，反向5’-CGTAGAGCTGAAGTAAGGCTGAC-3’；U6正向5’-GTAGCGGAGGCTAGGCGAGGAG-3’，反向5’-CGCTCGACATAGACAGGCGACGGC-3’；GALNT4正向5’-TGCTCCGTACCATTCACAGT-3’，反向5’-TCC

AGGAAAGTGAGGACGTC-3’；β-actin正向5’-CTAYY

GGCAACGAGCGGTTC-3’，反向5’-CTTAGGAGTGGGG

GTGGCTT-3’。2-△△Ct法计算miR-519a-3p相对于U6、GALNT4 mRNA相对于β-actin的表达量。

1.2.4 Western Blot法检测细胞中蛋白表达:各组转染后的细胞接种于6孔板中(1.0×105个/孔)，培养24 h后，用RIPA试剂提取细胞中总蛋白。经BCA法定量、SDS-PAGE电泳、转膜和封闭后，分别用GALNT4(1∶1 000)、MMP-2(1∶800)、MMP-9(1∶800)、Cleaved-caspase-3(1∶1 000)、p-PI3K(1∶2 000)、p-AKT(1∶2 000)、β-actin(1∶1 000)一抗孵育液4℃孵育过夜。洗膜后，再用山羊抗兔二抗(1∶5 000)37℃孵育1 h。加化学发光试剂避光显影，曝光拍照，Image J软件分析目的蛋白相对于β-actin的表达量。

1.2.5 Transwell检测细胞迁移和侵袭:将各组转染后的细胞密度调整为5×104个/ml。迁移实验：Transwell上室加100 μl细胞悬液，下室加500 μl培养基，培养24 h后，弃培养基。经多聚甲醛固定、结晶紫染色后，显微镜观察。随机取5个视野，计数。侵袭实验：在Transwell上室铺Matrigel基质胶，自然晾干后，再加100 μl细胞悬液，剩余实验步骤同迁移实验。

1.2.6 流式细胞仪检测细胞凋亡:各组转染后的细胞接种于24孔板中(1.0×104个/孔)，培养24 h后，收集细胞。利用Annexin V-FITC试剂盒，上流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.2.7 miR-519a-3p与GALNT4靶向关系验证:PCR扩增含miR-519a-3p结合位点的GALNT4的3’UTR序列，克隆至pMIR-Rport质粒，构建GALNT4野生型质粒(WT-GALNT4)。同时，将结合位点利用基因突变技术进行突变，克隆至pMIR-Rport质粒，构建GALNT4突变型质粒(MUT-GALNT4)。将对数期NCI-H1299细胞接种于6孔板中(1.0×105个/孔)，分别共转染WT-GALNT4与miR-519a-3p mimic、WT-GALNT4与miR-NC、MUT-GALNT4与miR-519a-3p mimic、MUT-GALNT4与miR-NC。6 h后更换培养基。再培养24 h，收集细胞并裂解。离心(3500 r/min，5 min)，取上清液检测荧光素酶活性，结果以萤火虫荧光强度与海肾荧光强度的比值表示。同时将miR-519a-3p组、miR-NC组、anti-miR-519a-3p组、和anti-miR-NC组细胞接种于24孔板中(1.0×104个/孔)，24 h后Western Blot法检测GALNT4蛋白表达，方法同1.2.4。

2 结果

2.1 miR-519a-3p和GALNT4在肺癌细胞系中的表达 肺癌细胞系NCI-H1299、NCI-H2170和PNCI-H1975中miR-519a-3p的表达均低于正常肺上皮细胞BEAS-2B(P<0.05)，而GALNT4 mRNA和蛋白的表达高于BEAS-2B细胞(P<0.05)。由于NCI-H1299细胞中miR-519a-3p和GALNT4表达与BEAS-2B细胞比较差异最显著，因此选择NCI-H1299细胞进行后续研究。见图1,表1。

图1 Western blot检测肺癌细胞系中GALNT4蛋白表达

表1 miR-519a-3p和GALNT4在肺癌细胞系中的表达

2.2 高表达miR-519a-3p对肺癌细胞NCI-H1299迁移、侵袭和凋亡的影响 miR-519a-3p组NCI-H1299细胞中miR-519a-3p表达高于miR-NC组(P<0.05)，说明高表达miR-519a-3p的肺癌细胞NCI-H1299构建成功；miR-519a-3p组NCI-H1299细胞迁移和侵袭数、细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达均低于miR-NC组(P<0.05)，而凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表达高于miR-NC组(P<0.05)，说明高表达miR-519a-3p可阻碍肺癌细胞NCI-H1299迁移和侵袭，而促进其凋亡。见图2，表2。

图2 高表达miR-519a-3p对NCI-H1299细胞迁移、侵袭和凋亡的影响；A Transwell检测高表达miR-519a-3p后NCI-H1299细胞迁移和侵袭(结晶紫染色×200)；B 流式细胞仪检测高表达miR-519a-3p后NCI-H1299细胞凋亡；C Western blot检测高表达miR-519a-3p后NCI-H1299细胞中MMP-2、MMP-9、Cleaved-caspase-3蛋白表达

表2 高表达miR-519a-3p对NCI-H1299细胞迁移、侵袭和凋亡的影响

2.3 低表达GALNT4对肺癌细胞NCI-H1299迁移、侵袭和凋亡的影响 si-GALNT4组NCI-H1299细胞中GALNT4蛋白表达低于si-NC组(P<0.05)，说明低表达GALNT4的肺癌细胞NCI-H1299模型构建成功；si-GALNT4组NCI-H1299细胞迁移和侵袭数、细胞中MMP-2和MMP-9蛋白表达均低于si-NC组(P<0.05)，而凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表达高于si-NC组(P<0.05)，说明低表达GALNT4可阻碍肺癌细胞NCI-H1299迁移和侵袭，而促进其凋亡。见图3，表3。

图3 低表达GALNT4对肺癌细胞NCI-H1299迁移、侵袭和凋亡的影响;A Transwell检测低表达GALNT4后NCI-H1299细胞迁移和侵袭(结晶紫染色×200)；B 流式细胞仪检测低表达GALNT4后NCI-H1299细胞凋亡；C Western blot检测低表达GALNT4后NCI-H1299细胞中GALNT4、MMP-2、MMP-9、Cleaved-caspase-3蛋白表达

表3 低表达GALNT4对NCI-H1299细胞迁移、侵袭和凋亡的影响

2.4 miR-519a-3p靶向调控GALNT4表达 Starbase生物信息学软件预测显示，miR-519a-3p与GALNT4的3’UTR存在连续结合的位点。共转染WT-GALNT4和miR-519a-3p mimics的NCI-H1299细胞荧光光素酶活性低于共转染WT-GALNT4和miR-NC的NCI-H1299细胞(t=16.660，P<0.05)，而共转染MUT-GALNT4和miR-519a-3p的NCI-H1299细胞荧光光素酶活性与共转染MUT-GALNT4和miR-NC的NCI-H1299细胞无显著变化(t=0.892，P=0.386)。miR-519a-3p组NCI-H1299细胞中GALNT4蛋白表达低于miR-NC组(t=12.489，P<0.05)，anti-miR-519a-3p组NCI-H1299细胞中GALNT4蛋白表达显著高于anti-miR-NC组(t=4.484，P<0.05)。表明miR-519a-3p靶向负调控GALNT4表达。见图4，表4、5。

图4 miR-519a-3p靶向调控GALNT4表达；A starbase对miR-519a-3p和GALNT4结合进行预测示意图；B Western blot检测miR-519a-3p对GALNT4蛋白表达的影响

表4 miR-519a-3p对NCI-H1299细胞中GALNT4蛋白表达的影响

表5 双荧光素酶活性检测

2.5 高表达GALNT4逆转高表达miR-519a-3p对NCI-H1299迁移、侵袭和凋亡的影响 miR-519a-3p+pcDNA-GALNT4组NCI-H1299细胞中GALNT4蛋白表达、迁移和侵袭数及MMP-2和MMP-9蛋白表达高于miR-519a-3p+pcDNA-NC组，差异均有统计学意义(P<0.05)，而凋亡率、Cleaved-caspase-3蛋白表达低于miR-519a-3p+pcDNA-NC组，差异均有统计学意义(P<0.05)。见图5，表6。

图5 高表达GALNT4逆转高表达miR-519a-3p对NCI-H1299迁移、侵袭和凋亡的影响；A Transwell检测NCI-H1299细胞迁移和侵袭(结晶紫染色×200)；B 流式细胞仪检测NCI-H1299细胞凋亡；C Western blot检测NCI-H1299细胞中GALNT4、CyclinD1、Cleaved-caspase-3蛋白表达

表6 高表达GALNT4逆转高表达miR-519a-3p对NCI-H1299细胞迁移、侵袭和凋亡的影响

2.6 Western Blot检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达 miR-519a-3p组NCI-H1299细胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表达显著降低于miR-NC组(P<0.05)；miR-519a-3p+pcDNA-GALNT4组NCI-H1299细胞中p-PI3K和p-AKT蛋白表达显著升高于miR-519a-3p+pcDNA-NC组(P<0.05)。见图6，表7。

表7 Western Blot检测PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达

3 讨论

miRNA可靶向其靶基因的表达参与调控细胞的增殖、凋亡和分化等过程，与人类肿瘤的发生发展中密切相关[6,7]。研究显示，miR-519a-3p在耐替莫唑胺(TMZ)的胶质母细胞瘤(GB)细胞中表达降低，上调其表达可靶向抑制RRM1降低耐TMZ的GB细胞增殖、迁移、侵袭和上皮-间质转化(EMT)[8]；上调miR-519a-3p可靶向抑制PDRG1减弱骨肉瘤细胞的增殖、迁移性及EMT，miR-519a-3p/PDRG1轴为骨肉瘤的治疗提供了新的分子靶点[9]。本研究显示，肺癌细胞系中miR-519a-3p的表达明显低于肺上皮细胞，提示其可能作为抑癌基因参与肺癌发生发展。通过转染miR-519a-3p模拟物高表达NCI-H1299细胞中miR-519a-3p后，NCI-H1299细胞迁移和侵袭数显著减低，且与迁移和侵袭相关的蛋白MMP-2和MMP-9的表达降低，表明高表达miR-519a-3p可抑制肺癌NCI-H1299细胞迁移和侵袭。诱导肿瘤细胞凋亡是肿瘤治疗的一种途径[10]。本研究显示，高表达miR-519a-3p后，NCI-H1299细胞凋亡率及凋亡相关蛋白Cleaved-caspase-3表达显著升高，说明高表达miR-519a-3p可诱导NCI-H1299细胞凋亡。

本研究利用双荧光光素酶报告基因实验和Western Blot证实了miR-519a-3p靶向负调控GALNT4表达。研究显示，高表达miR-365通过靶向下调GALNT4表达抑制乳腺癌细胞生长，并增强细胞对氟尿嘧啶的敏感性[11]；miR-506-3p的基因沉默可增强GALNT4的表达，从而加速前列腺癌的发展进程[12]。本研究显示，GALNT4在肺癌细胞系中呈高表达，低表达GALNT4抑制肺癌细胞的迁移和侵袭性，并促进肺癌细胞凋亡，这与Xing等[13]的结果一致，提示靶向降低GALNT4表达可延缓肺癌发生发展进程。本研究还显示，高表达GALNT4逆转了高表达miR-519a-3p对肺癌细胞迁移和侵袭的抑制作用及凋亡促进作用，提示高表达miR-519a-3p通过靶向负调控GALNT4表达发挥来抑制肺癌细胞的迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡，miR-519a-3p/GALNT4轴可能为肺癌的分子治疗提供了新途径。

PI3K/AKT信号通路是参与调控肿瘤细胞增殖、分化、凋亡和转移等过程的重要通路[14,15]。研究表明，过表达miR-141-3p通过靶向下调PTEN并激活PI3K/AKT信号通路促进卵巢癌A2780细胞的增殖和侵袭，并抑制细胞凋亡[16]；miR-489通过靶向HDAC7阻断了胃癌细胞中PI3K/AKT信号通路的激活，抑制胃癌细胞增殖、迁移和侵袭[17]；miR-425-5p在肺癌组织中表达升高，其通过激活PI3K/AKT信号传导促进肺癌发生发展[18]。本研究显示，高表达miR-519a-3p抑制肺癌细胞中PI3K/AKT信号通路的激活，而高表达GALNT4逆转了高表达miR-519a-3p对肺癌细胞中PI3K/AKT信号通路的抑制作用，提示miR-519a-3p通过靶向负调控GALNT4并抑制PI3K/AKT信号通路来阻碍肺癌细胞迁移和侵袭，并加剧细胞凋亡。

综上所述，miR-519a-3p在肺癌中呈低表达，高表达miR-519a-3p可有效抑制肺癌细胞迁移和侵袭，并诱导细胞凋亡，其作用机制可能与负调控GALNT4表达并抑制PI3K/AKT信号通路的激活有关。