补阳还五汤对2型糖尿病大鼠肾组织Wnt蛋白表达影响研究

邵天瑞，史翠娟，吴深涛

(天津中医药大学第一附属医院/国家中医针灸临床医学研究中心，天津 300381)

糖尿病是临床常见的内分泌系统疾病，其中超过90%的糖尿病为2型糖尿病，大血管系统(心血管疾病)和微血管系统(糖尿病肾病、糖尿病视网膜病变和神经病变)并发症是糖尿病患者死亡的主要原因[1-2]。该病的发病机制复杂，其中无翅型MMTV整合位点家族/β-连环蛋白(wingless type MMTV integration site family/β-catenin,Wnt/β-catenin)信号通路在糖尿病肾损伤中起着关键作用，尤其是对系膜细胞、足细胞和肾小管细胞的损伤，Wnt信号也参与了肾间质纤维化和肾小球硬化的发生发展[3]，阻断Wnt/β-catenin信号通路的激活，抑制肾小管间质纤维化进程，可最终发挥肾脏保护的作用[4]。目前西医治疗糖尿病及其并发症的手段有限，而以辨证论治为主、注重症状改善的中医药疗法对糖尿病及其并发症的治疗具有明显优势。现代医学与中医学的结合，以及生化指标的使用，将为糖尿病患者提供更合理的治疗方法，同时减少其并发症的发生与发展[5]。补阳还五汤出自清代王清任的《医林改错》，是中医治疗缺血性损伤的传统名方[6]。一项Meta分析显示，补阳还五汤治疗早期糖尿病肾病临床疗效更好，具有明显保护肾脏功能的作用[7]。本实验观察了补阳还五汤对糖尿病大鼠肾组织病理变化及Wnt蛋白表达的影响，以探讨其对肾脏保护作用的可能机制。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 健康雄性SD大鼠120只，体重(170±10)g，购于北京华阜康生物科技股份有限公司，实验动物许可证号：SCXK(京)2019-0008，实验动物使用许可证号：SYXK(津)2021-0003。饲养于天津易生源动物实验中心清洁级动物房。实验环境：温度18～22 ℃，相对湿度(50±10)%，噪声不超过85分贝，实验期间大鼠自由饮水和饮食，并保证每日更换垫料1次。

1.2药物及主要试剂 链脲佐菌素(STZ，Sigma，批号：S0130)；Wnt/β-catenin信号通路阻断剂XAV-939(MCE，批号：Lot:79157)；补阳还五汤(黄芪60 g、赤芍9 g、川芎6 g、当归9 g、地龙9 g、桃仁9 g、红花9 g，药物由天津中医药大学第一附属医院南院国医堂提供，中药房代煎后4 ℃保存备用；柠檬酸钠缓冲液(0.1 mol/L，pH 4.5)；Wnt4(EterLife EL611043)、Wnt5a(EterLife EL611044)、β-catenin(EterLife EL601047)、GAPDH(EterLife EL800402)抗体及相应二抗(索莱宝SE134)；血肌酐(SCr)和尿素氮(BUN)检测试剂盒[佰思诺(天津)生物科技有限公司]；HE染液套装[佰思诺(天津)生物科技有限公司]。

1.3实验方法 大鼠适应性饲养1周后，随机选择20只作为空白组，予以普通饲料喂养同时给予相同剂量的柠檬酸钠缓冲液腹腔注射。其余100只大鼠给予高脂饲料喂养8周，之后一次性腹腔注射STZ 35 mg/kg建立糖尿病模型，1周后空腹血糖(FPG)大于16.7 mmol/L表示糖尿病模型构建成功。造模过程中，大鼠死亡11只，血糖小于16.7 mmol/L的2只大鼠予以剔除，3只大鼠成模后即处死用于观察肾脏病变状态，将模型构建余下的84只成模大鼠随机分为模型组、阻断剂组、补阳还五汤组、补阳还五汤+阻断剂组，每组21只。阻断剂组大鼠给予XAV-939腹腔注射，5 mg/(kg·周)，连续4周；补阳还五汤组大鼠给予补阳还五汤灌胃，补阳还五汤整方药量111 g/d，按照人体重60 kg换算给药剂量，大鼠与人之间换算系数为6.25，大鼠用药量为6.25×111 g/60 kg=11.544 g/kg，为方便计算取剂量为11.5 g/(kg·d)，每日1次，连续4周；补阳还五汤+阻断剂组大鼠给予补阳还五汤灌胃及XAV-939腹腔注射，剂量及方法同阻断剂组和补阳还五汤组；空白组和模型组给予等体积生理盐水灌胃，1次/d，连续4周。

1.4观察指标及方法 ①称量各组大鼠干预4周末体重。②干预4周末腹主动脉取血，检测FPG、SCr和BUN水平。③采血后，大鼠在麻醉状态下处死，取肾脏组织，用生理盐水冲洗、称重，计算肾脏指数(肾脏指数=肾组织重量/体重)。④取大鼠其中一侧肾脏进行组织切片，采用苏木素-伊红染色(HE)法光镜下观察肾脏病理变化。 ⑤取大鼠另一侧肾脏，Western blot法检测肾脏组织中Wnt4、Wnt5a、β-catenin蛋白表达量：将肾组织从-80 ℃的冰箱中取出，先称量然后剪碎，放入1.5 mL离心管中，每100 mg组织加入裂解液1 mL、PMSF 10 μL，用玻璃匀浆机裂解，离心5 min，收取上清即为总蛋白溶液，BCA法测蛋白浓度。电泳槽内放入蛋白预制胶，其次加电泳液，最后上样，进行电泳，在溴酚蓝跑出后，停止电泳。随后根据分子量切割胶体，在电转液中，按照正极-负极方向叠放海绵、滤纸、胶、PVDF膜、滤纸、海绵，将电泳槽放入冰盒中，时间比分子量多转1 min。封闭在孵育盒中进行，将封闭液倒入盒中，每格子10 mL，摇床speed 50，2 h。加入经TBST稀释后的β-catenin抗体(1∶500)、WNT5A抗体(1∶500)、WNT4抗体(1∶500)、GAPDH抗体(1∶1 000)，在4 ℃冰箱内孵育过夜。TBST溶液漂洗5 min，重复4次。加入经TBST稀释后的山羊抗兔二抗(1∶2 000)，孵育1 h。将PVDF膜放入ECLA、ECLB等体积混合液体中1～2 min后取出，将残液擦净，置于暗匣曝光，最后进行显影、定影。胶片扫描、存档，进行颜色处理，测定灰度值。

2 结 果

2.1实验结束各组大鼠存活情况 给药前空白组大鼠20只，模型组及给药3组大鼠各21只，整个实验期间模型组大鼠因高血糖状态死亡2只，阻断剂组、补阳还五汤组和大补阳还五汤+阻断剂组大鼠分别死亡5只、6只、8只，1～3周每周各组分别取材3只，用于另一对照实验中。故至第4周时，每组分别剩余8只、7只、7只、6只、4只大鼠。

2.2各组大鼠体重、血糖及肾脏指标比较 干预4周后，模型组大鼠体重明显低于空白组(P<0.05)，FPG、BUN水平和肾脏指数均明显高于空白组(P均<0.05)，血清SCr水平与空白组比较差异无统计学意义(P>0.05)；阻断剂组大鼠血清BUN水平、补阳还五汤+阻断剂组大鼠体重和补阳还五汤组大鼠FPG、BUN水平均明显低于模型组(P均<0.05)，补阳还五汤+阻断剂组大鼠血清SCr水平明显高于模型组(P<0.05)；阻断剂组、补阳还五汤组大鼠体重均明显高于补阳还五汤+阻断剂组(P均<0.05)，而SCr水平则明显低于补阳还五汤+阻断剂组(P均<0.05)。见表1。

表1 空白组和糖尿病各组大鼠干预4周后体重、FPG及肾脏指标比较

2.3各组大鼠肾脏组织病理学表现 光镜下观察显示，空白组大鼠肾小球结构清晰，形态规则，肾小囊整齐紧密排列，肾小管结构、分布无异常；模型组大鼠肾组织结构紊乱，肾小球肥大，基质增生，系膜增厚，部分肾小管细胞出现空泡样变性；与模型组比较，阻断剂组、补阳还五汤组和补阳还五汤+阻断剂组大鼠肾组织病理改变均不同程度改善，以补阳还五汤+阻断剂组改善最为明显。见图1。

图1 空白组和糖尿病各组大鼠干预4周后肾组织病理HE染色表现 (×400)

2.4各组大鼠肾脏组织中Wnt蛋白表达情况 干预4周后，模型组大鼠肾脏组织中Wnt5a、Wnt4、β-catenin蛋白相对表达量均明显高于空白组(P均<0.05)。与模型组比较， 阻断剂组大鼠肾脏组织中Wnt4蛋白相对表达量和补阳还五汤组、补阳还五汤+阻断剂组大鼠肾脏组织中Wnt5a、Wnt4、β-catenin蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05)；补阳还五汤+阻断剂组大鼠肾脏组织中β-catenin、Wnt5a、Wnt4蛋白相对表达量均明显低于阻断剂组(P均<0.05)，Wnt5a蛋白相对表达量明显低于补阳还五汤组(P均<0.05)。见图2及表2。

1为空白组；2为模型组；3为阻断剂组；4为补阳还五汤组；5为补阳还五汤+阻断剂组图2 空白组和糖尿病各组大鼠干预4周后肾脏组织中Wnt5a、Wnt4和β-catenin蛋白表达情况

表2 空白组和糖尿病各组大鼠干预4周后肾脏组织中Wnt5a、Wnt4和β-catenin蛋白相对表达量比较

3 讨 论

糖尿病以多饮、多食、多尿及原因不明之消瘦等为主要临床表现，随着病程延长可出现大血管、微血管、周围或内脏神经、肌肉、骨关节等各种并发症[8]。中医药治疗糖尿病不仅有降糖作用，还常兼有调节血脂、改善微循环、保护肝肾功能等作用[9]。刘献明[10]报道，益气养阴活血化瘀法可有效降低2型糖尿病患者血糖水平，改善患者症状。吴晓艳等[11]报道，益气养阴活血化瘀法联合缬沙坦治疗早期糖尿病肾病可减轻患者的氧化应激和微炎症状态，改善肾功能，延缓肾损害进展，其效果优于单一西药治疗。冷伟等[12]报道，在西药治疗基础上联合补阳还五汤辅助治疗早期糖尿病肾病，可进一步提高近期疗效，且有助于抑制肾纤维化及氧化应激反应。以上临床研究表明，中药活血化瘀方对糖尿病及其相关并发症具有一定的改善作用。

补阳还五汤方中黄芪大补元气，气旺以促血行，瘀去络通；当归活血通络而不伤血；赤芍、川芎、桃仁、红花助当归活血祛瘀；地龙通经活络，力专善走，并引诸药之力直达络中。合而用之，共奏益气活血、化瘀通络之效[13]。故补阳还五汤多用于气虚血瘀之中风后遗症，近年来被广泛应用于心血管疾病、糖尿病及其大血管、微血管并发症等多种气滞血瘀证治疗中。本实验通过建立糖尿病大鼠模型，观察发现补阳还五汤灌胃可明显降低血糖，说明补阳还五汤单方可有效控制糖尿病大鼠的血糖。

中医认为糖尿病以肺、胃、肾为主要病变脏腑，尤以肾为关键。疾病早期肺燥胃热肾虚，故“三多”之症常相互并见，若病程日久，阴损及阳，可致阴阳俱虚，其中以脾肾气阳不足较为多见，而病久入络，血脉瘀滞，又极易损伤肾脏[14]。本实验研究发现，模型组大鼠血清SCr、BUN水平升高，肾脏指数增加，肾组织切片染色显示肾小球和肾小管发生病变，说明糖尿病大鼠肾脏功能受损；补阳还五汤组大鼠肾小球和肾小管病变减轻，血清SCr、BUN水平和肾脏指数降低，说明补阳还五汤可改善糖尿病引起的肾脏损伤；补阳还五汤与Wnt/β-catenin信号通路阻断剂同时应用，大鼠肾组织病理形态学明显改善，但血清SCr、BUN水平异常升高，这可能与该组大鼠的最终剩余数量过少导致统计数量不足，或药物间的相互影响等有一定关联，有待后续进一步研究。

近年来研究表明，Wnt信号通路异常可能诱发胰岛素抵抗及2型糖尿病，激活的Wnt/β-catenin信号通路可能参与了肾损伤和肾纤维化，抑制或调整Wnt信号通路的药物可能有助于防治糖尿病及糖尿病肾病[15]。白璐等[16]研究发现，Wnt/β-catenin通路的激活参与了糖尿病肾病大鼠的病情进展，该通路中Wnt4、β-catenin在肾脏中高表达，化瘀通络中药可抑制Wnt4、β-catenin过表达。本实验结果显示，模型组大鼠肾脏组织中Wnt5a、Wnt4、β-catenin蛋白均高表达；与模型组比较， 阻断剂组大鼠肾脏组织中Wnt4蛋白相对表达量和补阳还五汤组、补阳还五汤+阻断剂组大鼠肾脏组织中Wnt5a、Wnt4、β-catenin蛋白相对表达量均明显降低，且补阳还五汤+阻断剂组大鼠肾脏组织中Wnt5a、Wnt4、β-catenin蛋白相对表达量均更低。说明Wnt/β-catenin信号通路阻断剂以及补阳还五汤均能有效抑制糖尿病大鼠肾脏组织中Wnt蛋白的高表达，这可能是补阳还五汤改善糖尿病大鼠肾损伤的作用机制之一。

综上所述，补阳还五汤能明显降低糖尿病大鼠血糖，保护肾脏功能，改善肾脏病理损伤状态，其机制可能与抑制肾脏Wnt/β-catenin信号通路激活有关。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。