补阳还五汤减轻脑缺血再灌注损伤的信号通路研究进展

辛紫媛，高维娟，2

(1. 承德医学院，河北 承德 067000；2. 河北中医学院，河北 石家庄 050091)

清朝王清任著《医林改错》中首先提出了由多草药复合而成的经典中医方剂补阳还五汤，主要由黄芪、当归、赤芍、地龙、川芎、红花和桃仁七味药组成，具有补气推动血行、祛瘀通络之效，在抑制神经细胞的凋亡、兴奋性氨基酸的毒性、氧自由基的损伤、炎症细胞的聚集等方面发挥作用，对抗脑血管疾病不良损伤疗效显著[1]。脑缺血再灌注损伤(cerebral ischemia reperfusion injury,CIRI)是参与缺血性脑血管疾病中一系列复杂生理与病理功能级联反应的基础,成为缺血性脑卒中(cerebral ischemic stroke，CIS)治疗中亟待解决的关键难点[2]。由于CIRI后导致大量神经元和神经胶质细胞坏死，患者将出现不同程度的局部脑组织功能障碍和神经损伤，激活一系列反应参与其发生发展进程[3]。目前补阳还五汤干预CIRI取得了一定进展，但其机制尚不完全清楚，本文将对补阳还五汤在CIRI调节中的相关作用通路机制的进展进行综述。

1 PI3K/Akt通路机制

磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase/protein kinase B，PI3K/Akt)是在多种细胞内发挥抵抗凋亡、促进增殖等重要生物学功能的经典信号传导通路，除被用于研究过度激活可导致肿瘤无限增殖外，还在细胞的生存、代谢方面发挥重要作用,参与调节细胞自噬、减轻炎症反应、抗氧化应激等多种生物学过程, 因此成为CIRI的重要参与者[4-5]。

董元等[6]发现补阳还五汤改善了脑缺血损伤后大鼠的认知能力，明显缩小脑梗死脑组织的面积，诱导PI3K、p-Akt、B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2，Bcl-2)高表达，同时抑制下游凋亡促进基因Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 Assaciated X protein，Bax)的表达水平，保护海马的组织结构。Chen等[7]发现补阳还五汤可作用于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)进而通过激活PI3K/Akt通路介导下游靶点发挥生物学效应，使14-3-3蛋白(14-3-3 protein)与B淋巴细胞瘤-2基因相关启动子(Bcl-xL/Bcl-2asociated death promoter，Bad)结合产生抗凋亡作用，抑制细胞凋亡发挥对CIRI的神经修复作用与EGFR/PI3K/Akt/14-3-3信号级联通路调节有关。李峰等[8]发现脑缺血后内源性神经保护因子Apelin的受体APJ蛋白被Apelin激活后发挥诱导海马神经元再生，上调PI3K表达水平。补阳还五汤干预后的脑缺血大鼠中APJ、p-PI3K、p-Akt蛋白及APJ、Apelin mRNA表达上调进而减轻神经损伤。通过使用PI3K选择性抑制剂渥曼青霉素(Wortmannin)，可显著抑制Apelin/APJ的脑神经修复作用[9]。同时，PI3K/Akt通路是抗血小板活化、黏附和聚集的关键调节途径[10]。郑丽娴等[11]发现补阳还五汤可通过下调PI3K/Akt信号通路下游靶向因子与3-磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1(3-phosphoinositide dependent kinase-1，PDK1)及Akt蛋白上苏氨酸Ser473位点磷酸化的表达水平，抵抗PI3K/Akt通路激活，降低全血中血小板P-选择素(CD62P)含量，成为抗血小板活化、抑制血栓形成的关键信号通路之一。

以上研究提示补阳还五汤可通过促进PI3K/Akt通路发挥减轻缺血脑组织的凋亡，抑制其通路抗血小板活化，从而发挥对CIRI的保护作用。

2 丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)通路机制

MAPK是细胞胞浆内普遍存在的由丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)组成的蛋白激酶，在哺乳动物的大多数细胞中MAPK通路存在三个主要分支：p38丝裂原活化蛋白激酶(p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)，细胞外调节蛋白激酶1/2(extra cellular signal regulated kinases,ERK1/2)，c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)[12]。脑组织缺血时可在应激条件下与其下游靶点ERK1/2和p38MAPK发生级联反应，使神经元中的一种转录调节基因环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)发生磷酸化，参与神经再生、炎症和应激等反应,是参与CIRI调节中的重要媒介[13-14]。

孙立倩等[15]发现脑缺血后海马神经元结构损伤明显，使用补阳还五汤后可抑制磷酸化p38MAPK和神经损伤因子环氧合酶-2(cyclooxygenase-2，COX2)高表达，从而发挥神经细胞损伤后修复的功能。赵雅宁等[16]发现补阳还五汤组大鼠p-p38MAPK和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(Caspase-3)蛋白表达量显著低于模型组大鼠，凋亡神经细胞数量减少。补阳还五汤通过阻断p38MAPK级联反应，拮抗大鼠局灶性脑缺血损伤因子的激活，抑制凋亡相关基因或蛋白的转录与表达，有效减少神经元损伤[15-17]。

Jinglong等[18]发现补阳还五汤用药治疗30d后的大鼠，海马CA1区ERK2以及ERK2 mRNA的表达量显著增加，从而参与缺血区神经细胞生长和分化以及损伤的修复。Jover-Mengual等[19]发现ERK/MAPK信号级联反应和CREB的激活，在去卵巢雌鼠和沙鼠脑缺血损伤中发挥保护海马缺血CA1区神经元的重要作用。黄昕等[20]发现补阳还五汤能作用在ERK/CREB通路的下游基因p-ERK1/2、p-CREB1蛋白使其表达上调，此外应用膜性G蛋白耦联雌激素受体1(G protein-coupled estrogen receptor 1,GPER1)的特异性阻断剂G15可拮抗部分神经保护作用，补阳还五汤可发挥类雌激素作用诱导缺血侧海马DG区内源性神经再生。

此外，补阳还五汤还可通过调节MAPK通路级联反应，抑制p38MAPK和ERK1/2磷酸化表达，血管内皮细胞单层跨膜电阻值(TEER)显著升高，减少细胞骨架的变化，抑制膜通透性变大，改善细胞内皮损伤而发挥抗动脉粥样硬化作用[21-22]。

以上研究显示补阳还五汤可通过调节MAPK信号通路激活作用于下游p38MAPK和ERK1/2两个重要靶点，抑制其通路从而抗凋亡和抗动脉粥样硬化，促进其通路发挥类雌激素作用的神经再生与损伤后修复，表明补阳还五汤拮抗CIRI的发生发展与MAPK信号通路密切相关。

3 核因子-κB(nuclear factor-kappa B,NF-κB)通路机制

NF-κB是核因子p65和p50构成的同源或异源二聚体复合物，作为一种参与转录水平的调节蛋白，可发挥多向性调控编码细胞黏附分子、细胞因子、趋化性因子、生长因子、免疫受体、氧化应激相关蛋白酶、转录因子等方面的作用，参与介导炎症反应、细胞凋亡和先天性免疫应答，是CIRI产生后改善神经功能缺损，抑制缺血后脑组织损伤的主要机制之一[23-25]。

NF-κB信号传导通路与核因子κB抑制蛋白(inhibitor of NF-kappa-B，IκBs)结合时处于静息状态,包括IκBα、IκBβ和IκBε等[26]。郭乐[27]发现补阳还五汤可通过减少抑制因子IκB降解下调NF-κB/p65,NF-κB/p50磷酸化，通过调节NF-κB炎症信号通路抑制炎症因子，参与脑神经保护作用。Jin等[28]发现给予补阳还五汤后大鼠局灶性脑梗死面积有所恢复、病理损伤减轻，巢蛋白(Nestin)表达增加，通过抑制NF-κB和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α，TNF-α)活性，发挥抗炎症反应和抑制细胞凋亡作用，可明显改善体内大鼠脑缺血再灌注损伤和体外培养的HT22细胞损伤。高剑峰等[29]发现补阳还五汤可部分逆转老龄大鼠脑缺血再灌注后有促炎作用的NF-κB、诱导型一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、神经型一氧化氮合酶(nNOS)的相对高表达，拮抗部分神经毒性物质引起的神经系统结构和功能的破坏。董志强等[30]发现应用补阳还五汤可下调炎症因子TNF-α、白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)的表达水平发挥抗炎作用，其机制与阻碍Toll样受体4(Toll like receptor4，TLR4)作用于NF-κB中的接头蛋白髓样分化因子(myeloiddifferentiationfactor88，MyD88)，抑制TLR4/MyD88/NF-κB通路的激活而产生抗炎效应。

上述研究从NF-κB通路激活后不同蛋白表达水平，探讨补阳还五汤可通过合理有效抑制其通路的级联反应参与抗炎症反应、改善细胞凋亡的神经保护作用。

4 Notch通路机制

Notch信号通路是介导邻近细胞间短程信号的基本途径,当Notch配体与受体结合后被激活,广泛参与神经干细胞(neural stem cells，NSCs)的维持和神经发生进程，是治疗CIRI的重要靶点[31-32]。

吴增等[33]研究发现补阳还五汤可以抵抗NSCs移植后CIRI大鼠神经元凋亡,发挥修复神经损伤效应。周华忠[34]发现超微粉化后1/3量补阳还五汤可增强Notch受体Notch1与Notch配体Delta1结合的表达，反式作用放大Notch通路后诱导缺血侧细胞增殖，与全量补阳还五汤作用效应相同。张紫微等[35]发现对大鼠施以大脑中动脉栓塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型后用补阳还五汤治疗，可作用于其缺血侧脑组织，通过激活Notch通路上调下游主要靶点Notch1和重要效应分子Hes1、Hes5的表达水平，增强NSCs移植后的脑保护作用。涂建锋等[36]发现补阳还五汤在CIRI早中期上调大鼠海马区Hes1和Hes5蛋白水平发挥促进NSCs增殖效应，而在晚期显著抑制该表达水平发挥促进NSCs分化成为神经元作用，阐明通过Notch通路动态影响CIRI产生后内源性NSCs增殖水平。

提示补阳还五汤通过对Notch通路动态变化调控实验性大鼠MCAO模型NSCs的增殖和分化，是补阳还五汤作为治疗CIRI靶向药物的作用机制之一。

5 mTOR通路机制

哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,mTOR)是参与蛋白质转录、翻译过程的一种高度保守的丝氨酸/苏氨酸(Ser/Thr)蛋白激酶，以两种类型的多蛋白复合物mTORC1和mTORC2组成[37]。上游靶点可直接磷酸化mTOR或间接失活结节性硬化症复合体2(TSC2)增强mTOR的激活[38]。通常在癌症中被激活，但在缺血性疾病中却被失活，广泛涉及内源性神经损伤和自噬，是导致CIRI产生神经疾病的关键信号传导途径[39-40]。

TSC2的缺失可激活mTOR途径和其下游底物核糖体S6蛋白激酶(ribosomeprotein subunit 6 kinase 1，S6K1)活性，在细胞生长存活中处于中央调控位置[40]。和下游底物真核翻译起始因子4E结合蛋白1(e IF4E-binding protein 1，4E-BP 1)磷酸化后解离，启动mRNA蛋白翻译，促进细胞生长与增殖[41]。陈博威等[42]研究发现Cav-1小窝蛋白(caveolin-1, Cav-1)基因影响mTOR通路活性，加重脑缺血后神经功能损伤，同时脑缺血后Cav-1敲除小鼠mTOR蛋白及mRNA表达增加，作用于S6K1、4E-BP1使其磷酸化，而补阳还五汤可显著增强这种激活的强度，促进蛋白合成、抑制细胞凋亡。周胜强[43]通过调控细胞自噬的起始因子unc-51样激酶1 (unc-51-like kinase 1,ULK1) 蛋白靶点，发现预先应用补阳还五汤后的小鼠通过正向靶向调控Cavl/mTOR/ULK1通路活性，提高了缺血脑组织中mTOR Ser2448位点与ULK1的Ser757位点蛋白磷酸化表达水平，发挥脑保护效应。

由此可知，补阳还五汤可通过促进mTOR信号通路，抑制缺血半暗带自噬水平，可明显改善其神经功能缺失症状进而减轻CIRI。

6 核因子红细胞2-相关因子2(nuclear factor erythroid 2-related factor 2，Nrf2)通路机制

Nrf2是介导机体抵抗氧化应激损伤反应中的关键转录因子，Nrf2主要通过与启动子上的抗氧化应答元件(anti-oxidant response element,ARE)的结合,启动下游蛋白质转录和翻译，参与内源性抵抗氧化应激防御机制[44]。氧化应激时会产生过多的活性氧(ROS)，在CIRI的病理损伤中起着关键作用，此传导通路与CIRI密切相关[45]。

朱雪钦[46]发现大鼠脑CIRI后可激活Nrf2/ARE通路，增加了转录因子Nrf2和效应蛋白血红素加氧酶1(HO-1)基因表达水平，由于其活化程度被限制，不能完全恢复神经损伤，通过补阳还五汤干预后促进其通路进一步被活化，发挥抗内源性氧化应激，减少自由基损伤效应。佘颜等[47]发现补阳还五汤精简方可通过Nrf2/HO-1通路途径促进Nrf2的表达上调，进一步增加下游基因HO-1的表达，使脑缺血后血管内皮细胞增多，微血管密度增加，参与调节CIRI后血管新生。

因此补阳还五汤通过促进对Nrf2通路靶向干预，提高抗氧化应激防御的能力和促进血管新生，从而进一步改善CIRI。

7 酪氨酸蛋白激酶/信号转导子与转录激活子(the Janus kinase/signal transducer and activator of tranions, JAK/STAT)通路机制

JAK/STAT通路是细胞因子信号下游转导通路之一，将刺激信号由胞外转移到胞核调控细胞的发育、分化、增殖、凋亡等生物学效应。JAK2/STAT3信号通路被普遍认为是其通路中重要的一条，在CIRI发生后JAK2被激活招募STAT3磷酸化进而发挥调节作用[48]。

王凯华等[49]发现CIRI发生后JAK-STAT通路被激活，其下游靶点p-JAK2、p-STAT3的表达上调，通过给予JAK2抑制剂AG490和补阳还五汤干预后，抑制其靶点高表达，减轻神经细胞的缺血后凋亡。

上述研究表明JAK/STAT通路是调节CIRI修复的重要作用靶点，在CIRI发生后补阳还五汤可抑制该通路参与抗细胞凋亡作用。

8 Wnt通路机制

Wnt分子通路是一条广泛参与细胞的生长、分化、凋亡的高度保守信号途径，其中Wnt分子由细胞产生后分泌，传递给临近细胞并激活靶细胞的信号后，调控多种机理和生物学效应，Wnt/β-catenin作为Wnt信号通路的经典途径，对缺血性脑卒中的NSCs增殖、分化具有调节作用，进而有效保护CIRI后神经损伤[50-51]。

罗东[52]发现补阳还五汤治疗后可激活Wnt/β-catenin通路，增加MCAO小鼠海马区神经干细胞Wnt1、Wnt3a、β-连接蛋白(β-catenin)等Wnt构成因子的表达,促进神经再生的发生发展，同时缺血组表达同样上调但不及用药组明显。

表明补阳还五汤可通过进一步靶向促进Wnt信号传导途径改善神经病理性和功能性损伤，发挥脑保护作用，成为参与调控CIRI防治新策略的重点。

9 展 望

针对上述通路进行阐明确定补阳还五汤对于改善CIRI具有切实的效果，使我们能够对补阳还五汤发挥抗CIRI的作用机制作出一定解释。但还存在一些问题：①目前对于补阳还五汤治疗CIRI的发生机制仍尚未完全明确,研究多呈各个方向分散、实验研究方法过于单一，随着高通量测序(high-throughput Sequencing)发展,实现从转录组和基因组水平对各个信号通路的靶点分析，使进一步深入探索其作用机制成为可能。②已有研究表明补阳还五汤在治疗CIRI通过抵抗上游PI3K-Akt信号通路，其可能通过磷酸化eNOS产生NO，抑制NO/cGMP/PKG通路的活化，阻碍下游p38MAPK通路进而发挥抗血小板作用[53]。补阳还五汤作用于CIRI作用机制并非通过单一信号通路实现，不同的通路之间交织成网络相互调节的作用尚待研究，可通过网络药理学和代谢组学更加全面的探索其对CIRI的改善作用并进行网络构建。中药补阳还五汤以其多靶点、多途径的特点作用于CIRI患者后的药理效应具有巨大潜力，构建生物机制网络是未来新的研究方向，通过综合其复杂的药效分子机制研究思路以期为临床治疗提供参考。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。