添加Maillard反应前体物质对混有椴木屑暗棕壤腐殖质组成的影响

王 楠， 邵泽强， 马 超， 吴柏恩， 马 余， 王 帅

(吉林农业科技学院 农学院， 吉林 吉林 132101)

腐殖质(HS)是土壤有机质的主体部分， 是源于自然界的各类前体物质在微生物作用下经过一系列生物化学反应形成的、 具有多相分布且结构复杂的一类高分子化合物[1]. Maillard反应以游离氨基和糖类的胺醛缩合开始， 伴随一系列缩聚聚合和环化反应， 最终生成暗色且难以生物降解的高分子有机物， 尽管结构不同于HS[2]， 但Maillard反应前体物质对HS的形成有重要贡献. 通常经过两个阶段形成HS： 第一阶段为HS前体物质的生成阶段， 即有机质分解形成HS的中间产物， 如多酚、 氨基酸、 多糖和还原糖等过程； 第二阶段为前体物质聚合形成HS的阶段， HS前体物质在微生物作用下， 通过多酚理论、 Maillard反应等途径聚合形成HS[3]， 其中最关键反应为多酚的氧化缩合， 即通过微生物酶的氧化缩合作用， 以多酚、 糖类和氨基酸类小分子为起始物， 通过多酚-Maillard反应路径促进HS形成. 因此， 添加Maillard反应前体物质可促进腐殖化进程， 对HS形成有一定的激发效应[4].

自然界中的木质素储量丰富， 其降解与HS形成关系密切[5]， HS的芳香性主要源自木质素， 木质素和蛋白质可结合形成木质素-蛋白质复合体， 这是HS的核心[6]， 可见木质素对HS形成的贡献远大于纤维素， 但木质素的腐殖化进程较缓慢， 导致秸秆还田培肥效果欠佳以及堆肥腐熟周期过长. 因此， 研究Maillard反应前体物质的激发效应促进以木质素为主要成分的农业废弃物培肥土壤的效果具有重要意义. Fukuchi等[7]研究了天然沸石对邻苯二酚、 葡萄糖及甘氨酸间缩聚反应的催化作用， 结果表明， 沸石促进了缩聚反应; Hardie等[8]研究表明， 葡萄糖在δ-MnO2催化下可促进邻苯二酚的非生物腐殖化过程， 此外， 增加葡萄糖与邻苯二酚和甘氨酸间的物质的量比还可促进类似于HS的高分子物质产生； 文献[9]研究表明， 堆肥过程主要以Maillard反应合成HS； 文献[10]研究表明， 有机物料在堆肥过程中均受Maillard反应的影响； 文献[11]研究表明， 在牛粪与甘蔗共堆肥过程中添加尾气脱硫石膏后， 形成HS的芳香化和含氮化合物明显增加.

木质素难于腐解的特性影响了富含木质素农业废弃物培肥土壤的效果， 目前Maillard反应促进堆肥腐殖化进程的研究主要针对以木质素为主要成分的椴木屑， 而探索Maillard反应前体物质对其添加暗棕壤腐殖化进程的激发效应目前尚未见文献报道. 基于此， 本文采用室内恒温培养法， 通过添加Maillard反应前体物质， 在接种微生物菌剂条件下， 探索各前体物质对混有椴木屑暗棕壤腐殖质组成的影响， 研究3种前体物质对椴木屑在暗棕壤中的腐解特征及培肥效果的影响， 以期为椴木屑、 黑木耳菌糠、 秸秆等农业废弃物粉碎还田、 更好培肥土壤提供优质可行的助剂， 为农业废弃物催腐剂的研制提供理论依据.

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试土壤采自吉林市经济技术开发区猴石山海拔243 m的针阔混交林下， 土壤类型为暗棕壤； 椴木屑购于某木材商城. 葡萄糖、 邻苯二酚、 甘氨酸等试剂购于国药集团化学试剂有限公司.

微生物菌剂的制备： 准确称取秸秆腐熟剂(有效活菌数≥200亿cfu/g， cfu为菌落数， 由木霉菌、 芽孢杆菌、 放线菌、 假单胞菌、 乳酸菌、 酵母菌、 纤维素酶和蛋白酶等组成， 天津环微生物科技有限公司)1.0 g于100 mL无菌水中， 在28 ℃气浴振荡器中以120 r/min振荡提取2 h， 静止沉降30 min后以3 500 r/min离心15 min， 收集上清液， 备用.

1.2 实验设计

采用室内恒温培养法， 将45.0 g风干、 磨细过0.25 mm筛的暗棕壤与5.0 g椴木屑粉末混匀， 用喷壶均匀喷洒一定浓度的(NH4)2SO4溶液(w(N)=27.2%)调节混料适宜的含水量(w(H2O)=60%)和m(C)∶m(N)(C，N比， 25∶1). 实验共设3个处理， 在装有混料的三角瓶中分别添加5 mL 0.12 mol/L的邻苯二酚(catechol)、 葡萄糖(glucose)和甘氨酸(glycine)， 以无菌水为对照， 分别用Cat，Glu，Gly和CK表示， 每个处理重复3次后， 接种10 mL微生物菌剂， 用无菌透气膜封口， 于28 ℃恒温培养， 实验期间动态补水， 在培养0，30，80，150 d时动态取样， 取样后立即转入50 ℃鼓风干燥箱中风干， 终止微生物反应， 磨细过0.25 mm筛， 用于腐殖质组成分析.

1.3 测试方法

采用腐殖质组成修改法[5]对动态采集混有椴木屑的暗棕壤试样进行水溶性物质(water soluble substance， WSS)、 可提取腐殖酸(Humic-extracted acid， HE)、 胡敏酸(Humic acid， HA)、 富里酸(Fulvic acid， FA)及胡敏素(Humin， Hu)组分的提取， 同时测定各组分的含碳量(质量比，w(C))， 对其中HA碱溶液进行色调系数(ΔlogK)测定. 步骤如下： 准确称取1.0 g动态采集的混有椴木屑暗棕壤样品于100 mL聚乙烯离心管中， 加入30 mL蒸馏水搅拌均匀， 在70 ℃恒温水浴振荡器上提取1 h， 离心(3 500 r/min， 15 min)， 将上清液过滤于50 mL容量瓶中， 在带有残渣的离心管中继续加水20 mL搅拌均匀， 离心并将此次上清液与前次合并， 用蒸馏水定容， 所得溶液为WSS； 将蒸馏水替换为0.1 mol/L NaOH和0.1 mol/L Na2P2O7的混合溶液， 按上述步骤对残渣进行二次提取， 此次收集的溶液为HE； 离心管中残渣用蒸馏水多次洗涤， 直至洗液近中性， 将其转入50 ℃鼓风干燥箱中烘至恒质量， 得到Hu.

吸取30 mL HE溶液， 用0.5 mol/L的H2SO4将其pH值调至1.0～1.5， 置于70 ℃水浴锅中保温1.5 h， 静置过夜， 次日将溶液过滤于50 mL容量瓶并定容， 得到FA溶液； 先用稀酸洗涤滤纸上的残渣， 再用0.05 mol/L温热的NaOH将其溶解于50 mL容量瓶中， 用蒸馏水定容， 得到HA碱溶液， 各腐殖质组分的有机碳(w(CWSS)，w(CHE)，w(CHA)，w(CHu))质量比均用外加热-重铬酸钾氧化法测定， 差减法计算w(CFA)=w(CHE)-w(CHA)， 并根据w(CHA)和w(CFA)的结果计算二者比值, 即为胡富比(w(CHA)/w(CFA)). 采用北京普析通用仪器有限责任公司生产的TU-1901型紫外可见分光光度计对HA碱溶液的光密度(A400 nm和A600 nm)进行测定， 并计算ΔlogK：

ΔlogK=lgA400 nm-lgA600 nm.

1.4 数据处理

采用Excel 2003和SPSS 18.0软件对数据进行整理并进行差异显著性分析， 采用Excel 2003软件进行绘图.

2 结果与分析

2.1 对混有椴木屑暗棕壤水溶性有机物碳质量比及总有机碳的影响

图1为添加Maillard反应前体物质对混有椴木屑暗棕壤w(CWSS)的影响. 由图1可见， 随着培养的进行， 包括CK在内的4个处理， 其w(CWSS)均呈降低趋势. 与未培养相比， 培养30，80，150 d后， Cat，Glu，Gly和CK处理条件下w(CWSS)的降低幅度分别为47.8%，43.0%，50.4%，36.2%； 53.5%，56.7%，56.4%，44.2%和60.7%，57.7%，64.1%，77.5%. 其中经Gly处理培养30 d后的降低幅度最大， CK处理的降低幅度最小. 在培养80 d后， Glu处理的降低幅度最大， CK处理的降低幅度最小， 在培养150 d后， CK处理的降低幅度最大， Glu处理的降低幅度最小. 当培养结束后， 添加Maillard反应前体物质处理均低于CK的w(CWSS)降低幅度， 其中添加Glu处理的w(CWSS)降低幅度最小.

大写字母表示同一天数、 不同处理间的差异分析结果； 小写字母表示同一处理、 不同天数间的差异分析结果.

图2为添加Maillard反应前体物质对混有椴木屑暗棕壤TOC的影响. 由图2可见， 随着培养的进行， 各处理下混有椴木屑暗棕壤TOC均呈降低趋势， 与未培养相比， 在Cat，Glu，Gly和CK处理下， 暗棕壤TOC分别降低了27.2%，20.6%，29.7%和25.2%， 其中Gly处理的降低幅度最大， 其次为Cat处理， 二者均高于CK的降低幅度， Glu处理的降低幅度最小.

大写字母表示同一天数、 不同处理间的差异分析结果； 小写字母表示同一处理、 不同天数间的差异分析结果.

大写字母表示同一天数、 不同处理间的差异分析结果； 小写字母表示同一处理、 不同天数间的差异分析结果.

2.2 对混有椴木屑暗棕壤可提取腐殖酸碳质量比的影响

图3为添加Maillard反应前体物质对混有椴木屑暗棕壤w(CHE)的影响. 由图3可见， 添加Maillard反应前体物质的处理在各培养天数下w(CHE)均显著高于CK处理， 且CK处理在各培养天数下w(CHE)均无显著差异. 除CK处理外， 其余各处理w(CHE)均呈先降低后升高的趋势. 与未培养相比， 培养150 d后Cat，Glu，Gly和CK处理下w(CHE)的降低幅度分别为4.22%，3.70%，1.52%和0.48%， 其中Cat处理下w(CHE)的降低幅度最大， CK处理下w(CHE)的降低幅度最小.

大写字母表示同一天数、 不同处理间的差异分析结果； 小写字母表示同一处理、 不同天数间的差异分析结果.

2.3 对混有椴木屑暗棕壤胡敏酸碳质量比的影响

图4为添加Maillard反应前体物质对混有椴木屑暗棕壤w(CHA)的影响. 由图4可见： 在Cat和Glu处理条件下,w(CHA)均呈先升高后降低的趋势； 在Gly和CK处理条件下，w(CHA)呈逐渐降低的趋势. 在培养150 d后， 混有椴木屑暗棕壤w(CHA)降低幅度分别为27.9%，20.8%，23.5%和19.2%， 可见， 添加Maillard反应前体物质处理均高于CK的w(CHA)降低幅度.

大写字母表示同一天数、 不同处理间的差异分析结果； 小写字母表示同一处理、 不同天数间的差异分析结果.

图5为添加Maillard反应前体物质对混有椴木屑暗棕壤HA碱溶液ΔlogK的影响. ΔlogK是衡量腐殖质组分光学性质的重要参数， 其与分子结构的复杂程度呈反比， 即ΔlogK值越高， 分子结构越简单、 分子量越小[12]. 由图5可见， 随着培养时间的增加， 各处理下HA碱溶液ΔlogK变化规律不同， Glu和CK处理HA碱溶液ΔlogK逐渐增加， Cat处理HA碱溶液ΔlogK呈先降后升的趋势， Gly处理呈先升后降的趋势. 与未培养相比， 培养150 d后Cat，Glu，Gly，CK处理下HA碱溶液ΔlogK分别增加了6.5%，8.7%，1.8%和8.4%， 其中Glu处理的增加幅度最大， 大于CK处理， Gly处理的增加幅度最小. 可见， 添加Gly更有利于提高混有椴木屑暗棕壤HA分子结构的复杂程度.

大写字母表示同一天数、 不同处理间的差异分析结果； 小写字母表示同一处理、 不同天数间的差异分析结果.

2.4 对混有椴木屑暗棕壤胡富比的影响

图6为添加Maillard反应前体物质对混有椴木屑暗棕壤胡富比(w(CHA)/w(CFA))的影响. 胡富比是评价腐殖质品质的重要指标， 胡富比越大， 表明腐殖质品质越好[13]. 由图6可见， 随着培养的进行， Cat，Glu和Gly 3个处理条件下， 混有椴木屑暗棕壤胡富比呈先升后降的趋势， 在CK处理下， 胡富比呈降低趋势. 与未培养相比， 在培养150 d后， Cat，Glu，Gly和CK处理下胡富比降低幅度分别达37.7%，27.5%，35.9%和32.7%， 其中Cat处理的降低幅度最大， 其次是Gly处理， Glu处理的降低幅度最小. 当培养结束后， 添加Maillard反应前体物质和混有椴木屑暗棕壤的胡富比均显著低于CK， 不利于提升腐殖质品质.

大写字母表示同一天数、 不同处理间的差异分析结果； 小写字母表示同一处理、 不同天数间的差异分析结果.

2.5 对混有椴木屑暗棕壤胡敏素碳质量比的影响

图7为添加Maillard反应前体物质对混有椴木暗棕壤w(CHu)的影响. 由图7可见， 随着培养的进行， 除Cat处理下的w(CHu)先降低后略增加外， 其他3个处理下的w(CHu)均呈降低趋势， 与未培养相比， 在培养150 d后， Cat，Glu，Gly和CK处理下的w(CHu)分别降低13.1%，32.7%，27.4%和27.7%， 其中Glu处理的降低幅度最大， 高于CK， Cat处理的降低幅度最小. 因此， 与CK相比， Glu处理更有利于w(CHu)的矿化分解， Cat处理更有利于w(CHu)的积累.

大写字母表示同一天数、 不同处理间的差异分析结果； 小写字母表示同一处理、 不同天数间的差异分析结果.

3 讨 论

水溶性物质(WSS)是微生物能迅速分解利用的底物， 在腐殖质形成过程中起主要作用[14]， 总有机碳含量(TOC)是衡量土壤肥力的一个重要指标[12]， 通常腐解过程伴随TOC下降， 即TOC矿化分解为更稳定的有机分子进入腐殖质(HS). 随着培养的进行， 各处理下的暗棕壤水溶性物质碳质量比(w(CWSS))和TOC均呈降低趋势， 其中， 添加Maillard反应前体物质均低于CK暗棕壤w(CWSS)的降低幅度， 添加葡萄糖使暗棕壤w(CWSS)和TOC的降低幅度达到最小； 各处理w(CWSS)降低的主要原因是微生物腐解暗棕壤中的椴木屑消耗了该能源物质维系自身的生命活动所致[15]. 添加Maillard反应前体物质的处理， 由于额外添加了部分能源物质， 减少了对w(CWSS)的利用. 葡萄糖是微生物最易利用的碳源基质， 因此， 添加葡萄糖更有利于缓解微生物对w(CWSS)的消耗， 此外， 添加葡萄糖也在一定程度上抑制了微生物对TOC的矿化分解. Gao等[16]研究表明， 多糖通过Maillard反应可促进酚类的腐殖化作用， HS的形成可减缓w(CWSS)和TOC的矿化.

可提取腐殖酸(HE)是腐殖质中的活性部分， 具有较高的生物可利用性[1]. 添加Maillard反应前体物质均显著高于CK的暗棕壤在培养期间可提取腐殖酸碳质量比(w(CHE)). 可见， 邻苯二酚、 葡萄糖和甘氨酸均有一部分经微生物转化进入HE组分， HE的形成主要源于前体物质的聚合反应， 添加前体物质会促进堆肥腐熟程度并提高HS的生成数量[4]. 培养前期微生物获得外源物质对HE进行大幅度降解， 后期进行缩合[17]， 因此使w(CHE)在培养期间呈先降低后升高的趋势， 最终w(CHE)降低且降低幅度高于CK， 因此， 邻苯二酚、 葡萄糖和甘氨酸3种前体物质对HE的降解作用大于缩合作用.

胡敏酸(HA)是腐殖质中最活跃的组分， 在一定程度上可表征腐殖质的芳香性、 化学稳定性和有效性[18]， 其自然发生是由于多酚、 蛋白质、 木质素和糖等生物碎片的分解和转化所致. 添加Maillard反应前体物质的暗棕壤， 其胡敏酸碳质量比(w(CHA))的降低幅度均高于CK， 即邻苯二酚、 葡萄糖及甘氨酸3种前体物质对HA的降解作用大于缩合作用， 添加邻苯二酚和甘氨酸可使HA分子结构向复杂化方向进行， 更有利于提高HA分子中的芳香基团. 甘氨酸是最简单的氨基酸种类[19]， 邻苯二酚易被氧化成邻苯醌， 二者均可作为生物碎片加强HA分子的缩合， 使分子复杂程度有所提升[20].

富里酸(FA)是腐殖化反应的重要中间产物， 大多数HA通过FA进一步聚合而成[21]， 研究胡富比变化可直接揭示堆肥过程中HS的演变规律[22]. 在本文实验中， 添加Maillard反应前体物质的暗棕壤w(CHA)/w(CFA)均呈先增后减的趋势， 最终有所降低， 添加葡萄糖的暗棕壤低于CK的w(CHA)/w(CFA)降低幅度. 从该规律可以推断， 添加Maillard反应前体物质增加了微生物的降解能力， 使FA组分趋于降解， 然后部分FA发生缩合进入HA组分， 添加葡萄糖更有利于促进土壤有机碳活化与更新、 改善腐殖质品质[23]. 也可理解为HA比FA形成更早， 符合木质素-蛋白质理论和微生物合成学说[6].

胡敏素(Hu)是腐殖质中的惰性物质[24]， 具有比HA和FA更大的分子量和更高的聚合度， 表明Hu的稳定性更强[3]. 各处理下的暗棕壤胡敏素碳质量比(w(CHu))经培养均有不同程度降低， 其中添加葡萄糖更有利于w(CHu)的矿化分解， 邻苯二酚可在某种程度上促进碳固存， 抑制w(CHu)降解， 原因可能是添加邻苯二酚增加了微生物的降解负担、 削弱了对CHu的降解所致[25]. 可见， 添加葡萄糖可显著提高微生物的降解能力， 使Hu中的酰胺和多糖物质被微生物用作碳源[16]， 促进了惰性腐殖质组分Hu的降解并向活性腐殖质组分转化.

4 结 论

1) 随着室内培养的进行， 混有椴木屑的暗棕壤在各处理影响下， 水溶性物质及总有机碳含量均呈降低趋势， 其中， 添加Maillard反应前体物质使暗棕壤水溶性物质的降低幅度减小， 添加葡萄糖使水溶性物质及总有机碳含量的降低幅度最小.

2) 添加Maillard反应前体物质的暗棕壤在培养期间可提取腐殖酸碳质量比均显著高于CK处理， 呈先降低升的趋势， 经培养后可提取腐殖酸碳质量比有所降低且降低幅度高于CK处理； 添加Maillard反应前体物质使暗棕壤胡敏酸碳质量比的降低幅度更大， 其中， 添加邻苯二酚和甘氨酸使胡敏酸分子结构向复杂化方向进行. 添加Maillard反应前体物质暗棕壤的w(CHA)/w(CFA)均呈先增后减的趋势， 最终降低， 添加葡萄糖使暗棕壤w(CHA)/w(CFA)降低幅度低于CK处理.

3) 各处理条件下暗棕壤w(CHu)经培养后均有不同程度降低， 其中添加葡萄糖更有利于胡敏素的矿化分解.