接种内生真菌对蓝莓幼苗生长生理效应的影响*

安常蓉，李 芸，刘昌闳，崇慧影，文光琴，聂 飞，段如雁

（1 贵州省生物研究所，贵阳550009）

（2 贵州省植物园）

蓝莓，也称越橘，属杜鹃花科（Ericaceae）越橘属（Vaccinium）多年生灌木果树，是新兴的经济林树种之一[1]。蓝莓含有丰富的多种维生素、糖类、酸类以及多种矿质元素，具有多种食疗保健功效，因此被营养学家称为“21 世纪功能性保健浆果”，同时也是联合国粮农组织推荐的人类五大健康食品之一[2]。

蓝莓的根系没有根毛，根系结构简单，对水分和养分的吸收主要依赖于与其共生的菌根真菌[3]。1911 年，Coville[4]首先观察到高丛蓝莓根系中有菌根真菌寄生，并推测菌根真菌的侵染可能对蓝莓生长有益。尤其是近20 年来对蓝莓菌根的研究已成为热点，更多研究表明，接种菌根真菌可以促进蓝莓对土壤中矿质营养元素的吸收，促进植株生长，同时还调节植株自身内部的代谢活性，增强植株的抗性，提高蓝莓的产量等[5-11]。亦有研究表明，接种菌根真菌对宿主植物的生长并没有起到促进作用，接种内生真菌后宿主植物生长停滞、成活率降低等[12]。因此，接种后是否有促进效果受到多方面因素的影响，如植株因素、菌物因素等。对此，找出适合蓝莓无性繁殖苗生长的共生菌根是有研究意义的。本文以1 年生蓝莓无菌组培苗为研究材料，接种从栽培蓝莓植株根系上分离纯化的内生菌株菌液，通过定期监测苗木的生长，于生长旺期测定生理生化指标，生长结束期采集根系观察侵染情况，并采集植株测定生物量，最终初步筛选出适合蓝莓生长的菌株，这对于生产实践中蓝莓高效栽培具有理论指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料

（1）供试菌株。从毕节赫章和花溪高坡两地采集不同栽培品种蓝莓植株的根系，用冰盒带回实验室，将根系上土壤洗净，用75%酒精浸泡1 min，然后用1‰HgCl2浸泡10 min，取其幼根，在无菌条件下，用经过消毒的剪刀剪成长0.5 cm 的根段，选用PDA 培养基，每个培养皿中放置6 个根段，后将培养皿倒置在培养箱内，25 ℃避光培养。待培养基长出菌落后再用接种环挑取无污染的菌落继续在PDA 培养基进行纯化培养，直至得到单一菌株。纯化的菌株通过rDNA-ITS 全序列分析，对6 个菌株进行分子鉴定。

（2）供试植株。选择生长一致的1 年生蓝莓无菌组培苗，品种为莱克西。

（3）栽培基质。栽培基质为泥炭、草炭和珍珠岩等量混合，栽植前于121 ℃高压灭菌2 h。

（4）栽培容器。外口径14.5 cm、内口径13.5 cm、高12.5 cm 和底径10.2 cm 的塑料花盆于0.1%高锰酸钾溶液中浸泡消毒0.5 h。

1.2 方法

供试菌株在PDA 培养基上纯化后，接入PDB液体培养基上，于25 ℃下摇床培养7 d 左右。无菌组培苗种植5 个月后，将培养好的菌液浇灌蓝莓苗根部，以不浇菌液为对照（CK），每株苗木浇灌50 mL，每个处理3 次重复，每次重复10 株苗，隔5 d 浇无菌水，其间不施加任何肥料。浇菌液前测定每株蓝莓苗的苗高、地径（地径是苗干靠近基质处的直径，在测量之前先标记好，便于后面的测量），以后每隔30 d 测1 次，连续监测5 个月。选择持续向好的晴天，选择苗木位置相同并充分展开的5 株标准株功能叶片，测定蓝莓苗木的快速光响应指标和光谱效应指标，并采集叶片测定叶绿素含量。苗木生长结束后，选取每个处理10 株蓝莓植株的生活根连带部分根际土带回实验室，迅速清除根系表面的土粒和杂物，在自来水下冲洗干净，放在已编号的包埋盒里，用蒸馏水反复冲洗干净，放入10%KOH溶液中，将其置于90 ℃水浴锅中3 h，期间再换1次10%KOH 溶液，再通过一系列的染色、分色和制片过程后，在光学显微镜下观察菌根的侵染特征并拍照记录，同时采集植株根系测定根系活力、生物量等指标。

1.3 指标的测定

（1）苗高、地径的测量。用卷尺（精度0.1 cm）测量苗高，用游标卡尺（精度0.01 mm）测量地径。

（2）生物量的测定。计算每个处理植株的平均地径和平均苗高，按平均地径和平均苗高±5%选取5 株标准株，采集植株前先把每株的所有叶片收集好，洗净擦干后把根和茎（做好标记点以下的根系为根重，其余部分为茎重）分开，且分装在不同的牛皮信封纸袋中，后放入105 ℃烘箱中杀青30 min，再用80 ℃烘至恒重，并称量根、茎、叶各部分的干重。

（3）侵染率的计算。经染色的根段在乳酸甘油中脱色后，用剪刀剪取粗细均匀、长度约1 cm 的根段放在干净的载玻片上，每个载玻片放5 个根段，加盖干净的盖玻片，将压片放在显微镜下进行观察，每个处理放置8 个载玻片观察。在观察中，能够观察有菌丝的根段记为侵染的根段，相反，没有观察到任何菌丝侵染的根段为无侵染的根段。

侵染率（%）=（侵染的根段数/镜检根段总数）×100

（4）叶片光谱的测定。选择持续向好的天气，使用CI-710 光谱仪测定苗木位置相同并充分展开的5 株标准株功能叶片在400～1 000 nm 波长范围内的透射率、吸收率和反射率参数，每个处理测定3 次，取平均值。分析全部叶片测定的吸收、透射和反射的光谱曲线，发现固定波长范围内在470、550、670、780、880 nm 处有吸收峰，峰值波长漂移范围较窄，一般在±5 nm 内。因此选择波长位置位于470、550、670、780、880 nm 处的吸收光谱、透射光谱、反射光谱作为特征光谱变量。

（5）叶片光响应参数的测定。选择持续向好的晴天，用Junior-PAM 叶绿素荧光仪测定PAR（光合有效辐射）和ETR（相对电子传递速率）等，对曲线进行拟合后得到光能利用效率（α）、最大电子传递速率（ETRm）以及最小饱和光强（Ik）3 个主要参数。

（6）生理生化指标的测定。参照文献［13］，叶绿素含量的测定采用丙酮乙醇等比混合液法，根系活力的测定采用TTC 法。

1.4 综合评价法的确定

由于各指标的单位、性质和数量的不同，故采用模糊数学隶属度函数对各项指标测定值进行定量转换[14]。即f（Xi）=（Xij-Ximin）/（Ximax-Ximin）和f（Xi）=（Ximax-Xij）/（Ximax-Ximin），其中f（Xi）为各指标隶属度，Xij 表示各指标值，Ximax和Ximin 分别表示第i 项指标的最大值和最小值。将各处理的隶属函数值求和，数值越大则综合评价越高，并对不同处理的数值求和进行排序。

1.5 数据分析与处理

试验数据采用Excel 2010 软件进行统计和作图，采用SPSS 23.0 软件进行分析处理，采用Duncan’s 法进行多重比较。

2 结果与分析

2.1 通过ITS 序列分析的6 株菌株

通过鉴定分析，6 株菌株中有1 株蓝状菌属，4株青霉素，1 株枝孢属。其中，1 号菌株的最相似种为棘状踝节菌，相似度为99.82%。2～5 号菌株虽然是同属青霉素，但最相似种不同，2 号菌株的最相似种为柑橘青霉菌种，相似度为100.00%；3 号和5 号菌株最相似种为青霉菌种，相似度均为100.00%；4 号菌株的最相似种为油菜青霉菌种，相似度为99.81%。6 号菌株的最相似种为枝孢菌种，相似度为100.00%（表1）。

表1 通过ITS 序列分析的6 株菌株

2.2 接种不同菌株的蓝莓根系侵染特征及侵染率

通过台盼蓝染色法对所有蓝莓根系进行显微观察发现，侵染主要发生在根系为黄棕色的根段部分，菌丝的形态是由较粗的菌丝组成的密致的团状，细胞被菌丝充满。从表2 可以看出，接种不同内生真菌处理的蓝莓根系均观察到有侵染现象，且与CK相比差异显著。其中，2 号菌株的侵染率最高，达57.5%；其次是1 号和4 号，侵染率均为52.5%；5号菌株的侵染率最低，为45.0%。6 个菌株处理的蓝莓根系侵染率分别是CK 的4.2、4.6、4.0、4.2、3.6、3.8 倍。由此可见，没有接种菌液的CK 虽然有侵染，但人工接种菌液处理的侵染率显著高于CK。

表2 接种6 个菌株的蓝莓根系侵染率

2.3 接种不同菌株对蓝莓苗生长的影响

2.3.1 苗高和地径

从表3 可以得知，人工接种菌液促进蓝莓苗高生长。与CK 相比，1 号、2 号和4 号接种菌液处理的蓝莓苗高生长显著，3 号、5 号和6 号接种菌液处理的蓝莓苗高差异不显著。其中，接种1 号菌株处理的蓝莓苗高生长最好，比CK 增长39.27%；其次是2 号和4 号菌株；苗高生长较差的是5 号菌株处理，增幅仅为15.25%。

表3 接种6 个菌株对蓝莓苗高、地径的影响

同样，从表3 可以看出，人工接种内生真菌同样促进蓝莓苗木地径的生长。其中，1 号、2 号和5号菌株处理的蓝莓苗地径生长量较大，与CK 相比差异显著，3 号、4 号和6 号菌株与CK 相比差异不显著，各菌株处理的蓝莓苗地径与CK 相比增长幅度为9.43%～21.43%。

2.3.2 生物量

由表4 得知，接种内生真菌的蓝莓植株根、茎、叶的生物量和总生物量均高于CK。其中，接种2号菌株的蓝莓植株叶生物量、根生物量和总生物量均高于CK 且差异显著，分别是CK 的1.56、1.36、1.33 倍，接种1 号菌株的蓝莓植株茎生物量最重，是CK 的1.48 倍。对于总生物量而言，接种菌根处理的蓝莓植株均显著高于CK。就生物量分配来看，各处理的植株呈现地上部分生物量＞地下部分生物量；对于植株的不同部位，接种2 号、3 号、6 号菌株处理以及CK 的根生物量大于叶生物量、茎生物量；接种1 号、4 号菌株处理的茎生物量大于根生物量、叶生物量；而接种5 号菌株处理的则是叶生物量高于根生物量、茎生物量。可见，内生真菌对蓝莓植株的营养生长具有不同程度的促进作用，尤以接种1 号和2 号菌株的促进作用更明显。

表4 接种6 个菌株对蓝莓植株生物量及分配的影响

2.4 接种不同菌株对蓝莓苗叶片光谱效应的影响

2.4.1 叶片吸收率

由表5 得知，在470 nm 左右，各处理的蓝莓叶片平均吸收率最大，随着波长的增加，蓝莓叶片吸收率呈下降趋势，550 nm 左右各处理叶片出现较低的吸收率；随后，随着波长的增加，叶片吸收率呈上升趋势，在波长为670 nm 时蓝莓叶片出现较大的吸收率，但随着波长的继续增加，蓝莓叶片的吸收率明显下降，在780 nm 后平稳下降。此外，接种内生真菌的蓝莓叶片吸收率在各波长段均大于CK，表明接种菌株促进蓝莓叶片对蓝绿光和红光的有利吸收。

表5 接种6 个菌株对蓝莓叶片吸收率的影响

2.4.2 叶片反射率

从表6 可以看出，在测定波长范围内，接种不同菌株处理的蓝莓叶片反射率变化一致，叶片反射率在550 nm 左右出现峰值，之后在670 nm 左右叶片反射率最低，随着波长的增加，在780 nm 左右反射率迅速上升，形成“红边”现象，最后在近红外区域达到相对平稳，这与蓝莓叶片吸收率变化趋势不一致。另外，接种不同菌株处理的蓝莓叶片反射率变化的峰值均小于CK。

表6 接种6 个菌株对蓝莓叶片反射率的影响

2.4.3 叶片透射率

在测定波长范围内，接种不同菌株处理的蓝莓叶片光谱在550 nm 左右有较高的透射率（表7），在670 nm 左右其透射率降到最低，在780 nm 左右透射率快速增加，后随着波长的增加其透射率平稳增加。另外，接种各菌株处理蓝莓叶片透射率在470 nm 左右均大于CK，而在780 nm 和880 nm 左右其叶片透射率均小于CK，在其他波长范围内的透射率与CK 相比无明显的变化规律。

表7 接种6 个菌株对蓝莓叶片透射率的影响

2.5 接种不同菌株对蓝莓苗快速光响应主要参数的影响

通过对快速光响应曲线进行拟合，得到初始斜率（α）、最大电子传递速率（ETRm）、最小饱和光强（Ik）主要参数。由表8 得知，接种不同菌株对蓝莓苗快速光响应主要参数的影响差异显著。其中，快速光响应曲线的初始斜率表示光化学反应的启动速率，没有接种菌株（CK）的蓝莓苗初始斜率最高，而接种1 号菌株处理的蓝莓苗初始斜率显著低于CK，其他菌株处理的蓝莓苗初始斜率与CK 相比差异不显著，可见在光能利用之初蓝莓苗对光能利用效率变化不明显。

接种不同菌株蓝莓苗叶片最大电子传递速率与CK 相比差异显著。其中，接种4 号菌株的蓝莓苗叶片最大电子传递速率最高，其次是1 号菌株。各接种菌株处理的最大电子传递速率比CK 增加了33.11%～71.94%（表8）。

表8 接种6 个菌株对蓝莓快速光响应主要参数的影响

接种不同菌株的蓝莓苗最小饱和光强的变化与最大电子传递速率变化一致。接种不同菌株蓝莓苗的最小饱和光强与CK 相比差异显著，其中，接种4 号菌株的蓝莓苗最小饱和光强最高，其次是1号菌株。各接种菌株处理的最小饱和光强比CK 增加了53.55%～110.59%（表8）。

综合以上得出，接种4 号菌株的蓝莓苗叶片电子传递速率快，对强光的耐受能力强于其他菌株处理。

2.6 接种不同菌株对蓝莓叶片叶绿素含量和根系活力的影响

2.6.1 叶绿素含量

叶绿素是植物生长的主要光合色素，其含量可以在一定程度上反映植株进行光合作用的潜力。由表9 得知，接种6 个不同内生真菌处理的蓝莓叶绿素a 含量与CK 相比差异不显著；接种6 号菌株处理的叶绿素b 含量和叶绿素总含量与CK 相比差异显著，接种其他菌株处理的叶绿素b 含量和叶绿素总含量与CK 相比差异不显著。此外，接种6 号菌株处理的叶绿素总含量最高，为2.80 mg/g，是CK的1.5 倍；其次是2 号菌株处理，其叶绿素总含量为2.34 mg/g，是CK 的1.3 倍；接种5 号菌株处理的叶绿素总含量最低。相反，接种5 号菌株处理的叶绿素a/b 值最大，最小则为6 号菌株处理。

表9 接种6 个菌株对蓝莓叶绿素含量的影响

2.6.2 根系活力

根系活力指标能够间接反映根系生长情况和吸收营养状况水平。从图1 可知，接种不同菌株处理对蓝莓苗木根系活力的影响差异显著，其根系活力变化范围为103.08～236.13µg/g FW·h。其中，1号菌株处理的蓝莓苗木根系活力最大，为236.13µg/g FW·h；其次是2 号菌株处理，根系活力为186.57µg/g FW·h；苗木根系活力最小的是3 号菌株处理，为136.54µg/g FW·h。各处理的根系活力与CK 相比增幅为32.46%～129.07%。可见，接种菌株能显著提高蓝莓苗木的根系活力，从而促进植株对水分和养分的吸收。

图1 接种6 个菌株对蓝莓苗根系活力的影响

2.7 接种不同菌株处理的综合评价

由于各指标的单位、性质和数量的不同，采用模糊数学隶属函数法对各项指标进行定量转换。选用侵染率、苗高、地径、生物量、最大电子传递速率（ETRm）、叶绿素总含量和根系活力作为隶属函数综合评价指标。评价结果表明，接种不同菌株后对蓝莓苗促生效果最为显著的是1号和2号菌株，其次是4 号和6 号菌株，相对较差的是3 号和5 号菌株（表10）。由此可以初步筛选对蓝莓苗促生效果较好的菌株为1 号、2 号、4 号和6 号。

表10 接种不同菌株对蓝莓苗生长生理指标的综合评价

3 讨论与结论

根系侵染率是菌株侵染根系效果的直接体现，而根系的侵染受土壤条件和真菌源数量等因素的影响[15-16]，因此，有报道人工种植的蓝莓菌根形成率普遍较低[17]。肖军等以发酵菌液的方式对蓝莓进行接种，接种后蓝莓根系侵染率最高为63.3%[18]。本研究结果表明，在人工栽培蓝莓中接种不同种类的内生真菌，其侵染率最高可达57.5%，与前人的研究结果相似。另外，几种菌株处理的侵染率不一致，可能的原因是不同菌株与蓝莓根系的亲和力以及受其他因素影响的适应性不同所致。

菌根真菌对宿主植物水分、养分吸收最终体现在对植株生长的影响上。大量研究发现接种不同种类的菌株均对蓝莓的生长有显著的促进作用[19-22]。本研究结果同样表明，接种内生真菌均显著促进了蓝莓苗的生长，但各菌株对蓝莓苗生长以及对植株的不同部位生长效果不同，可能原因是各个菌株发挥作用存在差异性。

植物的生理生化特征决定了其对光谱的吸收、反射和透射的变化，而植物的生理特性又相应地反映了它的长势情况。其中，色素是影响植物在可见光区域内光谱特征的决定性因素。因此，可以通过检测植株对光吸收、反射和透射的变化间接估测叶绿素以及叶片水分含量的变化[23-24]。结合前人的研究，通过对比叶片吸收、透射和反射光谱曲线，选择470、550、670、780、880 nm 作为特征光谱波段，结果表明蓝莓叶片对光的吸收、反射和透射率都会随着波长的变化而有所不同。总体变化规律为各处理的叶片吸收率的峰值均大于CK，叶片反射率的峰值均小于CK，而叶片透射率与CK 相比无明显的变化规律，说明接种内生真菌能够促进蓝莓苗叶片对光能的吸收，而减弱光对叶片的反射和透射。

根系是植物吸收外界养分和水分的主要器官，而根系活力综合反映了根系养分吸收和物质合成能力。有研究表明蓝莓根系发育状况及蓝莓对菌根的依赖性与根系活力密切相关[25]。本研究中，接种6 种内生真菌都显著地提高了蓝莓苗的根系活力，从而促进了蓝莓植株的生长。

为了更直观地评价接种某种菌株对蓝莓苗侵染、生长生理效应的影响，选用侵染率、苗高、地径、生物量、最大电子传递速率、叶绿素总含量和根系活力作为隶属函数综合评价指标，评价结果表明，接种不同内生真菌后对蓝莓苗促生效果最为显著的是1 号和2 号菌株，其次是4 号和6 号菌株，相对较差的是3 号和5 号菌株，由此可以初步筛选对蓝莓苗促生效果较好的菌株为1 号、2 号、4 号和6 号。但对于自然环境中的栽培蓝莓而言，某种菌根真菌并不是单独孤立存在的，而是以多样性的方式存在。因此为了更好地模拟自然界中真菌-植物根系的共生状态，研究2 种或2 种以上的菌株共同接种对蓝莓苗生长发育的影响是今后研究的重点，这样能更好地提高植株的侵染率以及为生产实践服务。