羊精液保存冷冻稀释液的研究进展

朱大伟，罗联锋，徐策义，马舒蓝，张煜欣，胡建宏*

(1. 西北农林科技大学 动物科技学院，陕西 杨凌 712100；2. 陕西省宝鸡市金台区科技创新服务中心，陕西 宝鸡 721000)

随着人工授精技术越来越广泛的应用以及生产中对优秀种公畜精液的需要，对精液保存技术提出了更高要求。精液保存技术是指将精液与提前准备好的稀释液按照一定比例混合后，再按照专业的操作步骤对混合后的精液进行处理，以获得长期保存的效果。通过对公羊精液的保存能提高对优秀种公羊精液的利用率，充分发挥种公羊的生产效率，使用人工保存精液进行人工授精还可以减少公、母畜的接触进而减少疾病传播的可能性，提高养殖场生物安全。本文通过分析精液组成、精子特性和稀释液的成分，对精液保存稀释液的研究提供参考。

1 精液组成与精子特性

精液可分为精子和精浆两部分。精浆是由雄性生殖系统的副性腺产生的构成精子生存微环境的液体，不仅对精子在雌性生殖道内的运动起运输作用，而且能为精卵结合过程提供营养物质。宋国欣等研究表明，在公羊的精浆中存在的多种蛋白都与精子受精能力相关，例如BSP蛋白能在精子冷冻过程中使酪氨酸磷酸化水平下降而提高精子活力；伴侣蛋白能通过保护细胞内的肌动蛋白和微管蛋白的折叠而提高解冻后精子的运动能力。刘浩等研究表明，精浆中的微量元素如锌、铁等的含量与精子受精能力呈正相关。锌、铁含量偏低的个体不论是精子活力还是精子浓度都不及正常个体，此外精浆中的微量元素还能减少精子在体外受到的氧化损伤。

不同降温速率对精子活力的影响不同，降温过慢会使精子细胞内处于高渗状态容易涨破，而降温过快使细胞内结成大量冰晶，损伤细胞器和膜结构。乌日汉等对戴瑞羊的研究显示，60 ℃/min的降温速率使冻后精子质膜完整率、线粒体膜完整率和人工授精后胚胎卵裂率都保持较高水平。精子的生物特性表现为精子本身作为一个具有新陈代谢能力的生命体，对抗菌药物也具有敏感性，在配置保存液时加入的抗菌药物即使浓度较低也会影响精子的活力，因此在稀释液中使用抗菌药时应考虑到对精子的毒害作用。精子由头部、颈部和尾部3部分组成，其中头部为卵圆形，略扁，是细胞核和顶体存在的部位，顶体内存在的顶体酶、透明质酸酶等酶类对于精子穿过透明带完成受精过程具有重要作用；精子颈部是精子中最易受到损伤的部位，主要起连接精子头部和尾部的作用；精子尾部存在大量线粒体，是精子进行运动和能量代谢的主要部位，又可分为主段、尾段2部分。

2 精液保存稀释液成分

精液保存稀释液一般包括缓冲物质、抗冻物质、抗菌物质和抗氧化物质4种成分。缓冲物质可以保持精子内外渗透压稳定，防止精子形态发生改变；抗冻物质可以减少在低温状态下的精子损伤，延长精子寿命；抗菌物质能抑制细菌的生长，提高精子活力；抗氧化物质则是防止精子在体外环境被氧化。

2.1 缓冲物质

精浆中本身存在一定量的缓冲物质用以维持精子正常的生理功能，但是当精液被稀释后，精液中的渗透压平衡被破坏，若不额外加入缓冲物质则精子将会死亡。因此，从20世纪40年代开始科学家就研究精液稀释时可以使用的缓冲物质。目前用作精液稀释液中的缓冲物质主要有三羟甲基氨基甲烷(Tris)、柠檬酸钠等。Tris对精子基本没有毒害作用又具有良好的缓冲性、利尿性和渗透性，因此通常与柠檬酸钠、糖类等一起广泛应用于精液的保存，且最佳浓度一般为250～400 mol/L。Ike Osuagwuh等在公羊精液上的研究表明，Tris与葡萄糖组合使用的效果较果糖和蔗糖等更好，制作的冻精输精受胎率最高可达57%，因此目前Tris-葡萄糖配方是较为常见的冷冻稀释液配方。宣小龙等对夏洛莱羊的研究也显示，在稀释液中添加一定量的柠檬酸钠不仅能够使精液的pH值保持在6.8左右，给精子提供一个接近新鲜精液pH的环境，使解冻后的精子活力高达48%，而且柠檬酸钠还能使卵黄分散，促进精子运动。

2.2 抗冻物质

冷冻过程中的精子易受到冷应激，导致其超微结构以及功能产生损伤，这些损伤会使精子无法与卵子结合发生受精作用，而抗冻物质在冷冻过程中会优先从精子表面被去除，而减少精子受到的损伤，起到保护作用，因此在精液冷冻过程中添加冷冻保护剂具有极其重要的作用。目前使用的抗冻物质主要分为渗透性抗冻物质和非渗透性抗冻物质两大类。

渗透性抗冻物质如甘油、乙二醇等，能够在冷冻过程中进入精子细胞内部，增加细胞渗透压，降低冰核温度和冰晶尺寸，从而对细胞起到保护作用。非渗透性抗冻物质如大豆卵磷脂、十二烷基硫酸钠等存在于溶液中，通过避免解冻时溶剂进入精子细胞内涨破细胞起到保护作用。

甘油(丙三醇)是一种渗透性抗冻物质，能进入精子细胞内，通过与细胞内的水分脱出或结合，使水处于过冷状态，减少冷冻过程中冰晶的形成。曹访等通过向湖羊精液稀释液中加入不同浓度乙二醇、丙三醇、甲醇、二甲基亚砜等保护剂，测定冷冻-解冻后精子活率，发现以5%丙三醇作为冷冻保护剂效果最佳，能使解冻后精子活率达到39.5%。但是甘油具有粘稠性，会阻碍精子在子宫内的移动，同时甘油在常温下对精子有毒害作用，浓度过高时会增加精子的畸形率，因此甘油在绵羊颗粒法精液保存中常使用的浓度一般为3%～4%，而细管法冷冻常用浓度为6%～9%。

乙二醇可通过两种方式发挥抗冻作用：一是乙二醇能在温度降到零度以下时增加水跨膜运输的活化能，解冻时调节精子细胞内部的水运输过程，减少精子细胞在冷冻过程中形成冰晶；二是乙二醇能够通过保护精子细胞内的超氧化物歧化酶、谷胱甘肽过氧化物酶等具有抗氧化作用的物质，减少精子在冷冻过程中产生的活性氧自由基，提高精子细胞冷冻过程中的抗氧化应激能力。

卵黄是羊精液冷冻保存过程中的重要物质之一，卵黄中的磷脂酰胆碱和低密度脂蛋白(LDL)都能作为冷冻-解冻过程中的抗冻物质减少低温对精子的损伤，提高精子活力、顶体完整率和质膜完整率等指标。此外卵黄还能降低甘油浓度，减少甘油对精子的损害。

大豆卵磷脂作为一种对精子无害的非渗透性抗冻物质，被公认为可在精液冷冻保存中代替甘油。范文华等研究表明，在稀释液中加入2%的大豆卵磷脂就能起到与加入20%卵黄相同的保护效果，而同时使用10%卵黄+2%的大豆卵磷脂对精子的保护效果更好。刘文江等的研究表明，在山羊精液稀释液中加入1 g/L的大豆卵磷脂对精子细胞膜完整性的提高效果最佳，对顶体完整率没有显著影响。但是大豆卵磷脂难溶于水，若解冻后在体外保存时间过长可能会导致精子发生凝集死亡现象，限制了大豆卵磷脂在精液保存中的应用。

十二烷基硫酸钠(SDS)作为一种表面活性剂，在精液冷冻过程中能保护和修补精子的膜结构。宋玉坤等研究发现，添加1%的SDS后精子活率和直线运动率显著高于对照组，而畸形精子率偏低。此外高线粒体膜电位的精子比例虽没有明显增加，但表现出上升趋势。

在精子的冷冻保存过程中，为了减少冷冻过程造成的损伤，添加冷冻保护剂是至关重要的，但是不同的冷冻保护剂具有不同的特性，如渗透性保护剂会进入精子细胞内部，对精子产生一定的毒性作用，而一些动物源性的非渗透性保护剂可能会携带病原菌从而对精子产生不利影响，因此制作冷冻保存稀释液时选择合适的冷冻保护剂具有重要意义。

2.3 抗菌物质

精液以及精液稀释液中存在丰富的营养物质，会导致细菌微生物的大量繁殖，而微生物的生长不但会降低精子活力、影响受精能力和胚胎发育过程，输精后还可能导致母畜生殖道感染疾病。目前广泛使用的抗生素仍以青霉素、链霉素等为主，Hernández-Avilés等研究表明，与不加抗生素的对照组相比，试验组抑菌效果明显，且在冷冻状态下抑菌效果超过新鲜精液。但是使用抗生素不但对精子具有一定的毒害作用，而且会使细菌产生抗药性。为了有较好的抗菌效果，人们开始使用具有抗菌谱广、对精子细胞毒害作用较小或者无毒害作用的抗菌肽作为精液保存稀释液中的抗菌物质。

2.4 抗氧化物质

活性氧对保持精子活力具有极其重要的作用，一般通过在精液稀释液中添加抗氧化剂来中和形成的氧化自由基，以减少精子在体外的氧化程度。一般常用的抗氧化物质包括抗氧化酶、维生素、氨基酸和植物提取物。维生素B能够以辅酶的形式参与各种代谢过程，从光雷等研究发现，在冷冻液中添加2 mg/mL的维生素B能减少冷冻过程中膜脂质的过氧化作用，保持精子膜的完整性，并提高精子解冻后的运动性能。抗坏血酸能保护精子DNA免受氧化损伤，保证精子细胞遗传信息的完整。唐淑红等研究表明，当在精液稀释液中加入1 mmol/L的谷胱甘肽(GSH)时能减少精子活性氧的产生数量，对精子活力、顶体完整性、DNA完整性等都有显著提高。而对山羊冷冻精液而言，加入GSH后对提高体外受精率也有一定帮助。周凌博等研究发现，由松果体合成的褪黑素也可以减少精子受到的氧化损伤，与对照组相比，在培养液中加入10mol/L浓度的褪黑素能显著提高冻融后精子活力、运动能力、DNA完整性以及细胞内的ATP水平，同时还能减少受精后胚胎细胞的凋亡数量。吕春荣等研究发现，在稀释液中加入10 μmol/L的白藜芦醇能显著降低ROS的产生，并提高解冻后精子直线运动的百分率和质膜完整性，这说明白藜芦醇可以作为精液保存中的抗氧化物质，但是当白藜芦醇浓度过高时对精子活力反而会产生抑制作用，这可能是因为高浓度的抗氧化剂破坏了精子顶体结构。

3 小 结

随着畜牧业的发展和人工授精技术的推广，精液保存稀释液具有非常重要的作用。但是目前稀释液的各项成分仍存在各种问题，如甘油对精子的毒害作用、卵黄作为动物源性添加剂可能带来的感染问题、大豆卵磷脂难溶于水的问题等，都限制着精液冷冻保存技术的发展。在今后的研究中，寻找非动物源性添加剂和植物提取物代替现有的成分为解决这些问题提供了可能。