FAdV-4感染对SPF鸡血清生化指标的影响

张桂枝，赵晓阳，李新正，张晓战，靳双星*

(1.河南牧业经济学院，河南 郑州 450046;2.河南省家禽疾病防控工程技术研究中心，河南 郑州 450046)

鸡安卡拉病是由Ⅰ群禽腺病毒C种4型(FAdV-4)引起的一种急性、烈性传染病，感染鸡只表现心包积液-肝炎综合征及其他并发症[1]。近几年该病在中国广泛流行，河南[2]、黑龙江[3]、山东[4]等多个省份均有报道，主要发生于 1～3 月龄鸡，3～5周龄鸡最易感，最早出现于 7 日龄以下的雏鸡。817肉鸡、罗曼蛋鸡、三黄鸡、麻鸡等多个品种鸡均有发病报道[5]，鸵鸟和麻鸭也有感染发病[6-7]，给中国养禽业造成了巨大的经济损失。课题组对2019年禽病门诊接诊的病例进行统计，发现河南地区规模养鸡场FAdV-4感染严重。为了解FAdV-4感染对鸡血清生化指标的影响，采集患有心包积液-肝炎综合征为主要症状的病死鸡肝脏，在实验室进行病毒鉴定，将PCR鉴定为阳性的FAdV-4肝病毒液接种于易感日龄的SPF鸡复制病理模型，观察感染鸡的临床症状和病理变化，检测其血清生化指标，为进一步研究该病提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料及毒株来源 河南省中牟县某鸡场20～30 日龄肉鸡发病，主要表现为精神沉郁，鸡冠发白，排黄色硫磺样稀便，卧地不起，不久死亡，病死率较高。剖检心包内积有大量淡黄色透明的液体；肝脏肿大呈土黄色、质地变脆，有片状出血和点状坏死；肺脏瘀血明显，呈暗红色；肾脏肿大呈土黄色。采集发病鸡肝脏保存于-80 ℃超低温冰箱备用。

1.1.2 试验动物 SPF种蛋(购于北京勃林格殷格翰维通生物技术有限公司)，27 日龄青脚麻鸡(购买SPF种蛋)由河南省家禽疾病防控工程技术研究中心实验室孵化、出雏并饲养。

1.1.3 主要仪器 PCR仪(购自美国BIO-RAD公司)、GELDOCXR+凝胶成像分析系统(购自美国BIO-RAD公司)、离心机(购自德国Eppendorf公司)、微量移液器(德国Eppendorf 公司)、天平、研钵、微孔滤膜、血细胞分析仪、全自动生化分析仪等。

1.1.4 主要试剂 DNA 提取试剂盒、dNTP和Mix均购自康为世纪生物科技有限公司，FAdV-4引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。

1.2 方法

1.2.1 病料中病毒基因组DNA提取 取发病鸡肝脏，用灭菌剪刀剪碎，置于灭菌研钵内，按照5∶1(V/M)加入PBS液，并加入1000 U/mL青霉素、链霉素，研磨成液体，反复冻融3次，8 000 r/min离心10 min，取上清液经0.22 μm微孔滤器过滤，即为病毒提取液。滤液按照DNA 提取试剂盒(离心柱型)说明书提取DNA，将所得的 DNA 产物保存于-20 ℃冰箱储存备用。

1.2.2 病毒PCR鉴定 根据GenBank中禽腺病毒Hexon基因序列(No.KU587519)，参考田开丽[4]设计的引物，设计合成扩增 FAdV-4目的片段的引物，引物序列为：F:5'-TCCATCGACCAGATGGACAACGTCA-3'；R：5'-TTACACGGCGTTGCCTGTGGCGA-3'；预期扩增片段长度为1 347 bp。FAdV-4引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。以提取的基因组DNA 为模板进行PCR 鉴定，同时做阳性对照。

1.2.3 鸡胚半数致死量(ELD50)的测定 用灭菌的PBS液将病毒提取液10倍递次释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀释度，分别通过尿囊腔接种9日龄SPF鸡胚，每只鸡胚接种0.1 mL，每个稀释度接种7只鸡胚为1组，同时设立PBS液对照组，以石蜡封口，置于37～38 ℃培养，每天照蛋，24 h之内死亡的鸡胚弃掉，连续培养观察7 d，剖检鸡胚，记录每组死亡鸡胚数目，按照Reed-Muench法计算ELD50。

1.2.4 人工感染动物模型建立 50只27日龄青脚鸡随机分为2组，攻毒组和对照组各25只。攻毒组肌肉注射接种FAdV-4 阳性病料处理滤液0.5 mL/只，对照组肌肉注射0.5 mL/只PBS液，攻毒后饲养15 d，观察记录对照组和攻毒组鸡的精神状态、采食和饮水情况、粪便的变化，以及发病鸡的临床症状和剖检病理变化、死亡鸡只数等。

1.2.5 血液样品采集和检测 取攻毒组发病鸡血清样品15份，对照组血清样品15份，送至郑州颐和医院检测中心，检测血清中总胆红素(TBIL)、直接胆红素(DBIL)、间接胆红素(IDBIL)、碱性磷酸酶(AKP)、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)，总蛋白(TP)、白蛋白(ALB)、球蛋白(GLO)、肌酐(Cre)、尿酸(UA)和葡萄糖(GLU)等指标。

2 结果与分析

2.1 病料中FAdV-4的PCR检测

病料经PCR鉴定，扩增结果见图1。由图1可知，在病料中扩增到1 347 bp的特异性条带，表明所收集病料存在FAdV-4感染。

从图9中可以清楚的观察到，当铸膜液中添加不同粒径的ZIF-8后，膜机械性能呈现不同趋势的变化。其中，添加了70 nm的ZIF-8颗粒的MMM表现出最优异的机械性能。其抗拉强度、断裂伸长率和弹性模量均有改进。相比添加其他两种ZIF-8颗粒的MMM，添加40 nm的ZIF-8颗粒的MMM的弹性模量有一定减小，添加了100 nm的ZIF-8颗粒的MMM虽然断裂伸长率显著提升但是弹性模量有所降低。这些可能是由于其不同粒径造成的。

图1 FAdV-4 RCR检测

2.2 鸡胚半数致死量(ELD50)的测定结果

病毒提取液经不同稀释度稀释接种9日龄SPF鸡胚后，每日观察鸡胚死亡情况，按照Reed-Muench法计算ELD50，结果如表1所示。

表1 SPF鸡胚死亡

距离比例 =(70%-50%)/(70%-20%)=0.4，LgLD50=-4+0.4 ×(-1)=-4.4，则LD50=10-4.4，即将病毒提取液10-4.4稀释后，给SPF鸡胚接种0.1 mL，可以使50%的SPF鸡胚死亡。

2.3 人工感染动物模型的建立

攻毒后第1～2天攻毒组鸡无明显临床表现。第3天攻毒组6只鸡出现精神萎靡、头颈紧缩、闭目嗜睡、站立不稳等症状。第4天攻毒组发病鸡达19只，排淡黄绿色稀便，采食量和饮水量均下降，死亡5只。第5天攻毒组发病鸡出现鸡冠苍白，有贫血症状，死亡7只。第6天攻毒组鸡死亡2只，第7天攻毒组鸡死亡1只。第8天后攻毒鸡停止死亡，未死亡鸡只症状逐渐好转。攻毒组共死亡15只鸡，死亡率为60%(15/25)，死亡主要集中在第4～5天，发病率为76%(19/25)。对照组鸡均无异常变化。

剖检发病和死亡鸡只可见肌肉苍白(图2a)；心包内积有大量黄色透亮液体，心肌变软(图2b)；肝脏显著肿大，呈土黄色或淡褐色，质脆易碎，表面有大小不一瘀血斑和出血癍(图2c、图2d)；胆囊充盈，胆汁色淡，稀薄如水；脾脏肿大；肺淤血明显(图2e)；肾脏肿大，呈土黄色，质软易碎；胸腺萎缩；腺胃乳头稍肿大，靠近肌胃处轻微出血；粪便呈黄色(图2f)。

图2 FAdV-4感染鸡剖检症状

2.4 血清生化指标检测结果

血清生化指标检测结果见表2。由表2可知，攻毒组血清中总胆红素、直接胆红素和间接胆红素均极显著高于对照组(P<0.01)；血清中总蛋白和白蛋白含量均显著低于对照组(P<0.05)，葡糖糖含量极显著高于对照组(P<0.01)。攻毒组血清中碱性磷酸酶、谷草转氨酶和谷丙转氨酶均极显著高于对照组(P<0.01)；血清中γ-谷氨酰转肽酶略高于对照组，但二者之间无显著差异(P>0.05)；血清中肌酐和尿酸含量均极显著高于对照组(P<0.01)。

表2 血清生化指标检测结果

3 讨 论

3.1 人工感染动物模型的建立

FAdV-4是中国FAdV-I主要流行血清型[8-9]。本试验从河南地区发病鸡体内分离出FAdVH-4毒株，通过肌肉注射途径接种SPF鸡成功复制出FAdV-4感染病理模型，攻毒后第3天鸡只开始出现临床症状，第4天发病数达高峰，发病率达76%，死亡主要集中在第4～5天，死亡率为60%，第7天开始逐渐好转。说明该分离毒株具有高致病性。姜清云[10]研究了FAdV-4分离株GX01和N01对SPF鸡致病性，发现2组鸡均在感染后3 天出现临床症状，5～7 天发病达高峰，但两组鸡发病数目有显著差异。本试验FAdV-4感染鸡的发病时间、死亡高峰、临床症状和剖检病理变化与多数学者[11-13]报道的结果相似。不同的FAdV-4分离株感染后，鸡只的发病时间、发病率、病变程度、死亡率存在差异的原因可能与病毒接种量、接种途径、病毒毒力和接种日龄有一定关系。

3.2 FAdV-4感染对组织器官的损伤

许多学者[5,10,14]研究报道FAdV-4感染后肝组织受到严重损伤，大量病例肝脏先后出现细胞肿胀、颗粒变性、水泡变性、脂肪变性和坏死，坏死灶内可见大量巨噬细胞与淋巴细胞浸润增生，病变的肝细胞内可见核内包涵体，窦状隙狭窄甚至闭塞，胆小管内有大量胆汁淤积。牛玉娟[13]研究报道FAd V-4 的主要靶器官为肝脏和心脏，肝脏中病毒拷贝数在攻毒后第2天达到约106，第5天达到约108，攻毒后第3天肝细胞开始出现病变，第5天肝脏病变最为严重；病毒还诱导肝细胞发生凋亡和自噬，从而发生严重的肝功能障碍。本试验复制出的FAdV-4感染病鸡肝脏、心包、肺脏和肾脏病变最明显。肝脏显著肿大，呈土黄色或淡褐色，质脆易碎，表面有大小不一瘀斑和坏死点；心包内积有大量黄色透亮液体，心肌变软；肺淤血明显；肾脏肿大，呈土黄色，质软易碎。

3.3 FAdV-4感染对肝功能生化指标的影响

血液中的间接胆红素随血液运送到肝脏，被肝细胞摄取与胞浆中载体蛋白相结合后，被转运到滑面内质网生成葡糖醛酸胆红素(直接胆红素)。当肝细胞破坏时，对间接胆红素的摄取、酯化和直接胆红素的排泄都受到影响，引起血清中间接胆红素和直接胆红素均升高[15]。本试验结果显示，FAdV-4感染后鸡血清中总胆红素、直接胆红素和间接胆红素均显著升高，说明FAdV-4感染导致肝细胞对间接胆红素的处理能力下降，同时肝脏生成的一部分直接胆红素通过损伤的毛细胆管渗漏到血窦。

谷丙转氨酶主要存在于肝细胞浆内，为肝脏内活性最强的转氨酶之一，一般1%肝细胞受损，就会导致血液中谷丙转氨酶升高，该酶活性大小可以反映肝脏受损伤的严重程度。谷草转氨酶主要分布在心肌，其次是肝脏、骨骼肌和肾脏等组织中，当相应细胞受损时，胞浆内的谷草转氨酶释放入血，血清浓度可升高。碱性磷酸酶在动物机体内分布较广泛，在肝、肾、大小肠和胎盘等可以检测到，以肝脏最多，当肝脏受到损伤或者障碍时经淋巴途径和肝窦进入血液，同时肝内胆汁排泄障碍反流入血，引起血清碱性磷酸酶升高。本试验结果显示，FAdV-4感染后血清中碱性磷酸酶、谷草转氨酶和谷丙转氨酶均极显著升高，血清中γ-谷氨酰转肽酶略有升高，与前人[13-14]报道结果一致。

3.4 FAdV-4感染对肾功能生化指标的影响

鸡的肾脏是尿酸代谢的最重要器官，肾小管上皮细胞有生成和排泄尿酸两种功能，血清中的尿酸含量是评价禽类肾功能的重要指标之一，当肾小管细胞发生变性时，尿酸排泄受阻，会导致尿酸水平升高。肌酐为肌酸代谢的最终产物，血清肌酐通过肾小球过滤，不被肾小管重新吸收，经尿液排出体外；若肾脏受到损伤，肾小球的滤过率降低，会引起血清中肌酐水平升高。本试验结果显示，FAdV-4感染后血清中肌酐和尿酸水平显著上升，与前人[13]报道结果相似。

4 结 论

本试验通过肌肉注射肝脏病毒提取液成功复制出FAdV-4感染病理模型；FAdV-4感染可引起血清中总胆红素、直接胆红素、间接胆红素水平显著升高，总蛋白、白蛋白浓度显著下降，葡糖糖含量显著升高，谷丙转氨酶、谷草转氨酶和碱性磷酸酶活性显著升高，肌酐和尿酸水平显著上升。