谈忠毅 谈瑄忠▲ 许慧琴
盆腔炎性疾病(pelvic inflammatory disease,PID)是指女性上生殖道及其周围组织感染造成的一组疾病,包括盆腔腹膜炎、输卵管炎、子宫内膜炎和输卵管卵巢脓肿等,若得不到及时治疗,可能造成异位妊娠、慢性盆腔痛、不孕以及炎症反复发作等后遗症的发生,即盆腔炎性疾病后遗症(Sequelae of Pelvic Inflammatory Disease,SPID)。SPID多发于育龄妇女,其可出现组织被广泛的破坏和粘连、组织增生及瘢痕形成等病理改变,严重影响患者的身心健康[1]。中医治疗SPID具有明显的优势,消积颗粒是南京中医药大学附属南京中医院的院内制剂,是高淑华主任医师的经验方[2]。本方由赤芍、红花、香附、蒲公英、生薏苡仁、昆布等药味组成,临床上可明显改善SPID患者的症状。本实验旨在研究消积颗粒对SPID 模型大鼠的影响,探究其治疗机制,为SPID 的临床治疗及新药开发提供依据。
1.1 实验材料
1.1.1 药物 消积颗粒(由南京中医药大学附属南京中医院制剂部提供,批号:20160311)。
1.1.2 试剂 苯酚(成都市科龙公司,批号:20130515);黄耆树胶(国药集团,批号:W20111220);大鼠白细胞介素-6(IL-6)试剂盒(上海酶联生物有限公司,批号:201606);大鼠肿瘤坏死因子-α(TNF-α)试剂盒(上海酶联生物有限公司,批号:201606);大鼠血栓素B2(TXB2)(上海酶联生物有限公司,批号:201606);大鼠前列腺素1α(PGF1α)(上海酶联生物有限公司,批号:201606)。25%苯酚胶浆配制:取西黄芪胶1 g置干燥坩埚内,加4 mL甘油研磨均匀,再加液化苯酚5 mL,继续研磨至均匀状态,最后加蒸馏水11 mL研磨至浓稠均匀无颗粒。
1.1.3 动物 SPF 级未孕成年SD 雌性大鼠,体重200~220 g,由浙江省实验动物中心提供,实验动物使用许可证号:SYXK(苏)2014-0001。
1.1.4 仪器 TD 6001电子天平(天津市天马公司);FA2104 电子分析天平(上海精密科学仪器有限公司);CKX-31 生物显微镜(日本奥林巴斯);Synergy HT 多功能酶标仪(美国Bio TeK);LDZ5-2 离心机(北京医用离心机厂)。
1.2 实验方法[3-4]
1.2.1 造模 取雌性大鼠50只,随机选取40只大鼠采用腹腔麻醉(10%水合氯醛溶液4 mL/kg),常规消毒后,下腹正中切口约2 cm,暴露子宫,在右侧子宫中段处以4号针头小心进针,向卵巢方向缓慢注入苯酚胶浆0.04 mL/只,再逐层缝合切口,进行正常饲养。保留10只不造模作为空白对照。
1.2.2 分组及给药 造模7 d 后,将40 只大鼠按体重分层随机分为4 组,每组10 只,分别为模型组及消积颗粒低、中、高剂量组。消积颗粒低、中、高剂量组的给药剂量分别为2.6 g/kg、5.2 g/kg、10.4 g/kg;空白对照组、模型组则给予生理盐水。各组按上述剂量灌胃给药(10 mL/kg),每日1次,连续28 d。
1.3 观察指标
1.3.1 体征观察及体重 每天观察大鼠的毛发、精神、行为等体征状况;分别在给药前、给药后第1、2、3、4 w测定大鼠体重。
1.3.2 血液生化指标 末次给药后次日大鼠眼眶取血5 mL,待静置1 h 后,离心10 min(3000 rpm),取血清,保存温度为-20 ℃,后期用于测定血清TXB2、IL-6、TNF-α、PGF1α等指标。
1.3.3 脏器系数 脱颈椎处死大鼠,取出子宫、卵巢,称重并计算其系数。
1.3.4 病理组织学检查 取材后,将右侧子宫用10%甲醛溶液固定后,脱水,石蜡包埋。切片经HE染色,用光学显微镜进行观察。病理观察指标为:(1)子宫内膜上皮细胞变性坏死状况;(2)子宫壁慢性炎细胞浸润状况;(3)子宫腔扩张、粘连或闭塞状况;(4)子腔壁结构改变状况;(5)子宫内膜充血水肿状况[5]。第1、3项指标积分标准为:0分为无病变;1分为范围<1/3的轻度病变;2 分为范围在1/3~2/3 间的中度病变;3分为范围在2/3以上的重度病变。第2、4、5项指标根据病变严重程度计分:无明显病变为0 分;轻度病变为1分,中度病变为2分,重度病变为3分[5]。
1.4 统计方法采用SPSS 16.0 统计软件包,多组间比较采用单因素方差分析,组间两两比较采用t检验。
2.1 对体征及体重的影响模型组大鼠出现行为迟缓、精神萎靡、毛发蓬松等现象,且体重明显减轻,与空白对照组比较具有统计学差异(P<0.05或P<0.01);而消积颗粒低、中、高剂量组大鼠体征明显改善,体重在给药第2 w后明显增加,与模型组比较具有统计学差异(P<0.01)。见表1。
表1 各组大鼠体重的变化情况()
表1 各组大鼠体重的变化情况()
注:与空白对照组比较,#P<0.05,##P<0.01;与模型组比较,**P<0.01
2.2 各组大鼠IL-6、TNF-α水平比较模型组血清IL-6、TNF-α较空白对照组显著升高,而消积颗粒低、中、高剂量组IL-6、TNF-α均较模型组显著降低,差异具有统计学意义(P<0.01)。见表2。
表2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α水平比较()
表2 各组大鼠血清IL-6、TNF-α水平比较()
注:与空白对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,**P<0.01
2.3 各组大鼠TXB2、PGF1α水平及其比值比较与空白对照组比较,模型组血清中的TXB2升高,PGF1α降低,TXB2/PGF1α比值提高,两组差异具有统计学意义(P<0.01);而消积颗粒低、中、高剂量组均能降低TXB2,升高PGF1α,使其TXB2/PGF1α比值降低,与模型组比较差异具有统计学意义(P<0.01)。见表3。
表3 各组大鼠血清TXB2、PGF1α水平及其比值比较()
表3 各组大鼠血清TXB2、PGF1α水平及其比值比较()
注:与空白对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01
2.4 各组大鼠卵巢、子宫脏器系数比较各组大鼠卵巢系数未见明显差异;模型组子宫系数显著升高,与空白对照组比较具有统计学差异(P<0.01);而消积颗粒中、高剂量组均能降低子宫系数,与模型组比较差异显著(P<0.05或P<0.01)。见表4。
表4 各组大鼠卵巢及子宫系数比较()
表4 各组大鼠卵巢及子宫系数比较()
注:与空白对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05,**P<0.01
2.5 病理组织学检查模型组大鼠的病理表现为子宫内膜上皮细胞变性、坏死,宫壁结构改变,子宫腔粘连缩小、扩张或偏位,与空白对照组比较有统计学差异(P<0.01)。在使用消积颗粒后,子宫内膜上皮细胞变性、坏死及宫壁结构改变程度减轻,其中,中、高剂量组与模型组比较差异显著(P<0.05)。见表5、图1。
图1 各组大鼠子宫病理学检查结果
表5 各组大鼠子宫病理学评分结果()
表5 各组大鼠子宫病理学评分结果()
注:与空白对照组比较,##P<0.01;与模型组比较,*P<0.05
盆腔炎性疾病是妇科临床发病率较高的疾病,易反复发作,临床症状有下腹疼痛坠胀、腰痛、月经不调等,甚者可导致异位妊娠、输卵管阻塞和不孕[6]。该病可归属于中医学“妇人腹痛”“热入血室”“癥瘕”“不孕”等范畴[2]。中医临床实践认为,盆腔炎性疾病后遗症主要呈现“湿、热、瘀”的病理状态,究其病机特点,主要为湿热余毒为患。现代研究亦表明,盆腔炎患者的血液呈浓、黏、凝、滞状态,符合中医学“血瘀证”特点。本实验采用较为成熟的苯酚胶浆致炎法造模,造模7 天后肉眼观察模型组大鼠出现精神萎靡、行为迟缓、毛发蓬松等现象,且体重明显降低;病理主要表现为模型组子宫内膜上皮细胞突变坏死,宫壁结构改变,子宫腔粘连缩小、扩张或偏位[7]。消积颗粒能够改善SPID 大鼠的体征和体重,使子宫内膜上皮细胞突变坏死、宫壁结构改变程度减轻。IL-6作为启动炎症反应的关键因子,主要由单核巨噬细胞产生[8],对盆腔炎早期诊断具有重要意义。TNF-α 是由活化的单核巨噬细胞和其他多种细胞产生,具有广泛的生物活性,参与炎性反应和免疫应答[9]。消积颗粒能够显著降低模型组大鼠血清IL-6、TNF-α含量。由于PID时盆腔组织长期炎症侵蚀可引起增生、局部充血肿胀,产生炎性粘连和阻塞,从而引起子宫微循环的局部障碍,压迫神经纤维,引发腹痛等症状[10],消积颗粒能够显著降低TXB2/PGF1α比值,改善血瘀相关指标及微循环障碍。本实验研究发现,消积颗粒具有改善体征和体重,降低子宫系数、减轻炎症反应的作用,其作用机理涉及降低炎症因子、减轻血瘀、改善血液循环等多个环节。实验结果表明,消积颗粒具有抗苯酚致大鼠慢性盆腔炎的作用,为临床研究消积颗粒治疗SPID提供了理论依据,也为新药开发奠定了基础。