杂交野大麦新品系SSR与ISSR分子标记分析

吕玉茹， 李造哲,2， 云 岚,3

(1.内蒙古农业大学草原与资源环境学院， 呼和浩特 010011；2.内蒙古农业大学牧草种质创新与育种研究所， 呼和浩特 010011；3.草地资源教育部重点实验室， 内蒙古 呼和浩特 010011)

简单重复序列SSR(Simple Sequence Repeat)也称微卫星，它是由1～6个碱基为基本单元构成的重复序列，在各类真核生物基因组的不同位置中均有分布[1]。SSR标记扩增的谱带重复性好、多态性和分辨率高，已广泛应用于品种鉴定[2]、DNA指纹图谱[3]及遗传多样性分析[4]等方面。在SSR标记的基础上创立了一种简单重复序列区间扩增多态性分子标记技术，即ISSR(Inter-simple Sequence Repeat)也称加锚微卫星寡核苷酸技术[5]。ISSR标记引物专一性和重复性强，在指纹图谱的构建[6]、种质资源鉴定[7]及遗传多样性分析[8]等方面都有报道。

披碱草属和野大麦都是麦类作物的野生近缘种遗传资源，具有麦类作物缺乏的高产、优质、抗逆、抗虫和抗病等基因，通过杂交可丰富麦类作物的基因多样性[9]。将野生近缘种牧草的优良抗性基因导入麦类作物中，来提高其产量和抗性[10-12]。披碱草和野大麦本身是两种具有重要经济和生态价值、抗逆性强的优良牧草。披碱草具有抗旱、抗风沙和产草量高等特性，野大麦耐盐碱、草质好等特性。为了结合二者的优良性状，王照兰等[13]将披碱草和野大麦进行远缘杂交，获得了高度不育的披碱草和野大麦的正、反交F1代。李造哲[14]用回交法克服了杂种F1代的不育性，成功获得(披碱草×野大麦)×野大麦和(野大麦×披碱草)×野大麦的回交一代，并进一步培育成新品种(品系)。

为防止杂交后代形态特征不容易判定其真伪的问题，避免良种繁育过程中出现品种混杂现象，通过分子标记快速有效地鉴定杂交野大麦新品系的真实性具有现实意义。基于前期对杂交后代不同株系的RAPD、细胞遗传学、同工酶等方面的研究[15-17]，本研究利用ISSR、SSR分子标记对选育的杂交野大麦新品系Y33和P13进行鉴定，并构建其指纹图谱，从而为杂交野大麦新品系种质资源评价与利用提供依据。同时在DNA分子水平上比较新品系与双亲间的遗传差异，分析SSR和ISSR分子标记技术在披碱草和野大麦远缘杂种鉴定及遗传育种上应用的可行性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验材料为披碱草(ElymusdahuricusTurcz.)、野大麦(HordeumbrevisubulatumLink.)、Y33((野大麦×披碱草)×野大麦回交选育的新品系)、P13((披碱草×野大麦)×野大麦回交选育的新品系)。试验用ISSR[1]和SSR[19]标记引物(表1、表2)由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 ISSR标记引物信息Table 1 Primer information of ISSR marker

表2 SSR标记引物信息Table 2 Primer information of SSR marker

1.2 研究方法

1.2.1基因组DNA提取及检测

对4种试验材料分别摘取25个单株嫩叶，采用北京天根公司的植物基因组试剂盒提取基因组DNA。用微量核酸蛋白分析仪、1.0%琼脂糖凝胶电泳对DNA浓度、纯度及质量进行检测。将4种材料的25个基因组DNA分别等量混合，混合后根据用量稀释至30 ng/μL并置于4 ℃冰箱保存备用，剩余部分置于-20 ℃冰箱保存。

1.2.2PCR扩增及电泳

ISSR标记：PCR扩增反应总体积20 μL，包括DNA模板1 μL (30 ng/μL)，引物1 μL (10 μmol/L)，PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 8 μL。PCR扩增程序：94 ℃ 5 min (预变性)；94 ℃ 30 s(变性)，50 ℃ 45 s(依据引物的退火温度)，72 ℃ 1 min(延伸)，40个循环；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，每个样品点样6 μL，以DL 3000 Marker(北京天根公司)为对照。在电泳仪上恒压180 V预电泳30 min后在恒压200 V下电泳50 min，凝胶用UVP紫外凝胶成像仪照相保存。

SSR标记：PCR扩增反应总体积20 μL，其中有DNA模板1 μL (30 ng/μL)，上下引物各1 μL (10 μmol/L)，PCR Master Mix 10 μL，ddH2O 7 μL。PCR扩增程序：94 ℃ 5 min(预变性)；94 ℃ 30 s(变性)，50 ℃ 45 s(依据引物的退火温度)，72 ℃ 30 s(延伸)，35个循环；最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。PCR扩增产物用6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测，每个样品点样6 μL，以DL 3000 Marker(北京天根公司)为对照。在电泳仪上恒压180 V预电泳30 min后在恒压200 V下电泳90 min。凝胶用染色液(10%乙醇、0.5%乙酸和0.2%AgNO3)染色5 min，显影液(3% NaOH和0.5%甲醛)显影至条带清晰，用扫描仪拍照保存。

1.3 数据处理与分析

用Excel软件建立0、1数字统计表，有带记为“1”，无带记为“0”，统计扩增谱带。多态信息含量由公式PIC求得2Pi×(1-Pi)，Pi表示第i条谱带出现的频率。用Ntsys 2.10软件，计算遗传相似性系数，并用类平均法聚类分析构建聚类图。

2 结果与分析

2.1 基因组DNA的纯度检测

利用天根基因组试剂盒提取的亲本和杂交新品系基因组DNA，电泳条带清晰，基因组DNA纯度较高，可用于标记分析(图1)。

注：P为披碱草；Y为野大麦。下同。图1 基因组DNA纯度检测Fig.1 Genomic DNA purity test

2.2 ISSR标记结果分析

2.2.1引物多态信息

从22个ISSR引物中筛选出12个条带清晰且重复性较好的引物，检测结果如表3所示。每个引物可平均扩增出5.33个总条带和4个多态性条带；多态比率在50.00%～100.00%之间，平均多态比率达77.93%，其中UBC 807、UBC 808、UBC 848、UBC 857扩增出条带的多态比率为100.00%；多态信息含量的变化幅度在0.187 5～0.375 0之间。

表3 12个ISSR标记引物多态信息Table 3 Polymorphic information of 12 ISSR marker primers

2.2.2遗传相似系数及聚类图

表4为ISSR标记亲本与杂交新品系间的遗传差异分析。两个亲本间遗传相似系数为0.312 5，遗传差异较大；披碱草与两个杂交新品系间的遗传相似系数分别为0.359 4和0.406 3，野大麦与两个杂交新品系间的遗传相似系数分别为0.921 9和0.812 5，说明杂交新品系Y33和P13偏向轮回亲本野大麦遗传；杂交新品系间的遗传相似系数为0.828 1，新品系间遗传较为相似。聚类分析(图2)在遗传距离0.80处，新品系Y33和P13与亲本野大麦聚为一类，披碱草为一类；而在0.92处，新品系Y33和野大麦聚为一类。

注：C 1～C 4依次为披碱草、野大麦、Y33、P13。下同。图2 ISSR标记杂交野大麦新品系的聚类Fig.2 Cluster diagram of new hybrid H. brevisubulatum lines labeled by ISSR marker

表4 ISSR标记材料间遗传相似系数Table 4 Genetic similarity coefficients among ISSR marker materials

2.2.3指纹图谱

从ISSR标记筛选的多态性引物扩增的电泳图中，选择4个有代表性的引物UBC 811、UBC 822、UBC 845和UBC 856构建DNA指纹图谱(表5)，引物UBC 811(图3)在1 000 bp处，只有披碱草无条带，可将披碱草区别出；在700 bp处，野大麦和Y33有条带，在440 bp处，只有Y33有条带，可将野大麦和Y33区别出；在490 bp处，披碱草和Y33有条带，而P13在700 bp、490 bp和440 bp三个片段中都无条带，可将P13区别出。引物UBC 811能将4种材料彼此区分开。引物UBC 811的440 bp、UBC 822的1 450 bp、UBC 845的2 700 bp和UBC 845的1 200 bp可直接区别出Y33、披碱草、P13和野大麦。表5中不同引物的不同片段相互组合都可将4种材料区别开来。因此，ISSR标记有较强的品种鉴别能力。

注：M为DL 3000。下同。图3 ISSR标记引物UBC 811对杂交野大麦新品系的扩增Fig.3 Amplification map of new hybrid H. brevisubulatum lines by ISSR marker primer UBC 811

表5 杂交野大麦新品系ISSR标记指纹图谱Table 5 ISSR marker fingerprints of new hybrid H. brevisubulatum lines

2.3 SSR标记结果分析

2.3.1引物多态信息

6对SSR引物检测结果表明(表6)，平均条带总数为13.33，引物GST 37(图4)扩增出的条带最多(23条)，平均多态条带为8.83，GST 25扩增的多态条带最多(15条)；多态比率的范围为55.56%～100.00%，平均多态比率为69.22%，GST 127的多态比最高(100%)；多态信息含量从0.208 3到0.390 6不等，平均为0.274 5，多态信息含量最高是引物GST 127(0.390 6)。

表6 6对SSR标记引物多态信息Table 6 Polymorphic information of 6 pairs of SSR marker primers

图4 SSR标记引物GST 37对杂交野大麦新品系的扩增 Fig.4 Amplification map of new hybrid H. brevisubulatum lines by SSR marker primer GST 37

2.3.2指纹图谱

从SSR标记的6对多态性引物扩增的电泳图中筛选出3对有代表性的引物(GST 37、GST 1、GST 99)构建DNA指纹图谱(表7)。引物GST 37(图4)，在268 bp处，只有披碱草无条带，可将披碱草区分出；232 bp处，发现两个亲本有条带，可将野大麦区分出；在100 bp处，只有P13有条带，可将P13区分出；118 bp处，野大麦和P13有条带，而Y33在232 bp、118 bp、100 bp处均无条带，可将Y33区分出。引物GST 37能够鉴别出亲本和杂交野大麦新品系。引物GST 37的100 bp、GST 1的50 bp、GST 99的298 bp和GST 99的120 bp可直接区别出P13、Y33、披碱草和野大麦。表7中不同引物的不同片段相互组合都可将4种材料区别开来。因此，SSR标记可作为鉴别亲本和杂交品种的有力工具。

表7 杂交野大麦新品系SSR标记指纹图谱Table 7 SSR marker fingerprints of new hybrid H. brevisubulatum lines

2.3.3遗传相似系数及聚类图

据表8分析可知，两个亲本间的遗传相似系数为0.512 5；两个杂交新品系与披碱草的遗传相似系数分别为0.500 0和0.550 0，与野大麦的遗传相似系数分别为0.712 5和0.762 5，表明杂交新品系Y33和P13偏向轮回亲本野大麦遗传；两个杂交新品系间的遗传相似系数为0.850 0，说明在这几个位点上新品系间更为相似。从图5可看出，在遗传距离0.73处，新品系Y33和P13与亲本野大麦聚为一类，披碱草为一类；0.85处，两个新品系聚为一类。

表8 SSR标记材料间遗传相似系数Table 8 Genetic similarity coefficients among SSR marker materials

图5 SSR标记杂交野大麦新品系的聚类Fig.5 Cluster diagram of new hybrid H. brevisubulatum lines labeled by SSR marker

3 讨论与结论

DNA指纹图谱是鉴别生物个体之间差异的一种电泳图谱，其操作速度快、多态性丰富、特异性高、较稳定，是鉴别品种、品系(含杂交亲本、自交系)的有效方法[20]。郭海林等[21]用SSR标记技术构建了11个结缕草属优良品系的指纹图谱。该技术也可用于辨别杂种后代的真假性[22]。ISSR标记在建立指纹图谱方面也有报道[23]。李永祥等[18]分析了ISSR和SSR标记在披碱草属植物研究中的可行性，表明两种标记都可将属内的四倍体种和六倍体种区分开，在披碱草属植物种间分析是有效的，且不同标记有不同的多态性检测范围。本研究参考了鉴定披碱草属植物的两种标记引物，筛选出重复性好、条带清晰的12个ISSR标记引物和6对SSR标记引物的平均多态性位点百分率分别为77.93%和69.22%，两种标记的不同引物不同片段相互组合可鉴别出杂交新品系与亲本，重复检测出的特异性条带亮度较轻，说明还需要筛选更多的适合鉴定远缘杂交品种的引物。试验采用的品种数量也较少，对引物的有效性还有待在更多的品种上验证。若构建高样本量的指纹图谱数据库，供试品种也需要采集更多的位点，以完善指纹图谱数据库。

用ISSR和SSR标记方法对苜蓿属(Medicago)及其近缘植物进行分析，发现ISSR标记有更多的多态性位点，两种方法的聚类结果虽不完全相同，但都能区分出类群，结果表明，两种标记都可有效区分苜蓿属及其近缘植物的亲缘关系[24]。本研究的新品系Y33和P13是由披碱草属和大麦属植物进行远缘杂交并多年选育获得的，在两种标记的引物扩增图中也可看出，两个杂交新品系对亲本的DNA有继承也有缺失，还有自己特异的遗传信息。两种标记的遗传相似系数均显示，Y33、P13与野大麦的遗传相似系数高于披碱草。ISSR标记中Y33与野大麦聚为一类，SSR标记中Y33和P13聚为一类，但两种标记的Y33和P13都与亲本野大麦聚为一类，表明新品系Y33和P13偏向轮回亲本野大麦遗传，这与李造哲等[15]对披碱草和野大麦及其杂种F1代与BC1代RAPD分析的结果一致，杂种后代偏向轮回亲本遗传。ISSR标记技术对老芒麦(Elymussibiricus)和紫芒披碱草(Elymuspurpuraristatus)及其杂种F1代与BC1代的遗传差异分析也表明，BC1代偏向轮回亲本老芒麦遗传[25]。

综上所述，两种标记方法的研究结果一致，在远缘杂交野大麦种质资源鉴定研究中是有效的，但两种标记结果在品种鉴定和产权保护等方面的作用有待进一步验证。经ISSR、SSR标记分析，杂交新品系偏向轮回亲本野大麦遗传；两种标记构建的指纹图谱都能客观真实地检测出亲本与杂交后代间的遗传差异，可用于远缘杂种鉴定。引物UBC 811和GST 37可准确鉴别亲本与杂交野大麦新品系，可以在构建杂交野大麦品种指纹数据库中推荐使用。