丝素蛋白对斑马鱼高血脂模型的降血脂作用探究

李艾元, 施心雨, 刘梦斐, 李 诚, 岳万福, 游卫云

(浙江农林大学 动物科技学院·动物医学院,杭州 311300)

大量的流行病学调查和研究表明,高脂血症是目前动脉粥样硬化、冠心病和脑血管病发病的最重要因素[1-3]。高脂血症也是高血压、糖耐量异常、糖尿病的一个重要危险因素[4]。高脂血症还可导致脂肪肝、肝硬化、胆石症、胰腺炎、眼底出血、失明、周围血管疾病、跋行、高尿酸血症[5]。降脂药可降低这些疾病的发生率和死亡率,对心脑血管疾病的防治产生积极、深远的影响[6]。目前临床应用和处在研发阶段的降脂药物按其降脂机理和化学结构可分为他汀类、烟酸类、贝特类、胆酸鳌合剂类、多烯类、中药类等[7];他汀类药物,例如辛伐他汀(SIM)和阿托伐他汀(ATV)的药理功能是抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR),这是肝脏甲羟戊酸途径中胆固醇合成的关键酶。但现有的降脂药物存在疗效不佳、毒副作用较大或费用高等问题,因此开发新的降脂药物显得非常必要[8]。

大量研究表明,从自然资源中提取的大量生物化合物可以改善脂质代谢紊乱,因为它们对高脂血症的疗效很高,并且很少或没有不良副作用。其作用机理主要有三个方面:1) 降低血浆中的脂质水平,具有抗动脉粥样硬化活性;2) 降低血清中的总胆固(TC)和低密度脂蛋白(LDL)胆固醇水平;3) 通过调节肠道微生物群组成来发挥降血脂作用。蚕丝生物材料因其生物相容性和广泛的理想物理化学性质,在生物医学和组织工程方面的应用而闻名[9]。脱胶丝素蛋白已经在小鼠、绵羊、兔子、人类等哺乳动物细胞证明了丝素蛋白对宿主无免疫排斥和绿色可降解[10-11]。丝素蛋白可促进多种因子表达,降解的氨基酸可以被宿主动物吸收降解而没有副作用[12]。可以尝试作为降血脂药物的辅料来减少药物的毒副作用,或者单独作为药物替代产物来减缓高血脂的病症[13]。

斑马鱼与普通的模型动物相比,具有以下特性:1) 饲养成本低,性成熟周期短[14];2) 生长发育速度较快,在受精后24 h基本器官就可以发育完成;3) 胚胎及幼鱼透明便于观察药物在体内的扩散及吸收情况[15];4) 给药方式简单,培养基内直接给药,溶于水的小分子物质可直接通过循环系统进入幼鱼体内[16];5) 与人类基因具有85%相似性[6]。因此,使用斑马鱼可以评价丝素蛋白能否在降血脂方面的效用[17-19]。总的来说,斑马鱼具有体积小、产卵量高、发育迅速、胚胎及幼体透明等特点,并且与人类基因组具有高度同源性。

1 步骤与方法

1.1 材料与试剂

斑马鱼及斑马鱼培养基(南京一树梨花生物科技有限公司),丝素蛋白(杭州林然生物科技有限公司),荧光倒置显微镜(尼康映像仪器销售(中国)有限公司北京分公司),PBST缓冲液、油红O、二甲基亚砜(DMSO)、尼罗红(北京索莱宝科技有限公司),其余未列出试剂(北京索莱宝科技有限公司)。

1.2 斑马鱼高血脂模型的建立与检测

斑马鱼模型建立方法:采用文献[20-21]的方法,利用幼鱼循环系统可以与培养基进行物质交换的特性,在显微镜下挑选孵化后发育正常的斑马鱼卵放入96孔板,每孔各一个鱼卵,加入0.50%、0.10%、0.05%、0.01%的蛋黄培养液及空白组(养殖用水)。28 ℃恒温培养箱中继续培养48 h,观察鱼卵的情况,及时挑出死掉的幼鱼。

模型的检测方法:移除蛋黄培养液之后,PBS洗脱3次,用4%多聚甲醛4 ℃固定过夜,丙二醇梯度100%、75%、50%、25%脱水,油红O(1 μg/mL)和尼罗红(2 ng/mL)染色,PBST洗脱3次,荧光倒置显微镜观察拍照。用图像处理软件ImageJ和SPSS 22.0进行图像分析比较,计算处理组斑马鱼尾部血脂染色强度与空白组尾脂染色强度,可以检验斑马鱼高血脂模型是否建立成功。同时,挑选出4组浓度中模型建立最好的一组,作为高血脂模型进行下一步实验。

1.3 斑马鱼实验分组

设置6个实验组:3个化合物处理组、1个阳性对照组、1个溶剂对照组、1个空白对照组。移除96孔板中的培养基,PBS洗3次,化合物处理组分别加入0.1、0.5 μg/mL和1.0 μg/mL的辛伐他汀和同等质量浓度丝素蛋白;阳性对照组中加入0.05 μg/mL的辛伐他汀;溶剂对照组中加入0.10% DMSO;空白对照组中加入养殖用水,于28 ℃恒温培养箱中继续培养48 h。

1.4 斑马鱼高血脂荧光染色

移除培养液之后,PBS洗脱3次,用4%多聚甲醛4 ℃固定过夜,丙二醇梯度100%、75%、50%、25%脱水,油红O(1 μg/mL)和尼罗红(2 ng/mL)染色,PBST洗脱3次,荧光倒置显微镜观察拍照。

1.5 斑马鱼染色与结果分析

将斑马鱼转入96孔板中,每孔一尾,移除蛋黄培养基后用4%多聚甲醛4 ℃固定过夜,丙二醇梯度脱水,油红O(1 μg/mL)和尼罗红(2 ng/mL)染色,放入倒置荧光显微镜中观察荧光强度。将所得数据按照下式进行SPSS 22.0统计分析。

(1)

式中:A表示处理组染色强度;B表示对照组染色强度;C表示血脂降低率。

1.6 数据分析

用图像处理软件ImageJ和SPSS 22.0进行图像分析比较,计算模型组斑马鱼尾部血脂染色强度与空白组尾脂染色强度。统计学处理结果以±SE表示,多组间比较采用方差分析,两组间比较采用Dnnett’s T-检验进行统计学处理,P<0.05为差异性显著。最后,根据统计学处理结果评价丝素蛋白的降血脂能力。

2 结果与分析

2.1 斑马鱼模型建立与结果分析

斑马鱼高血脂的造模原理主要是:高胆固醇的饮食,通过斑马鱼的循环系统在体内血管不断积累,血液中的胆固醇逐渐升高,从而影响尾脂荧光染色的面积和强度。由图1(a～f)可以看出,随着培养基中蛋黄粉质量分数增加,斑马鱼尾脂的染色强度与面积逐渐增加。图1(i)数据分析结果表明,培养基不添加蛋黄粉的斑马鱼幼苗尾脂没有检测出荧光强度,培养基添加蛋黄粉的斑马鱼幼苗检测出荧光强度。各个质量分数的蛋黄粉培养基的荧光染色结果相比可以得出,培养基中蛋黄粉质量分数为0.50%时,与其他蛋黄粉质量分数组差异极显著(P<0.001);培养基中蛋黄粉质量分数为0.10%时,与0.05%质量分数差异不显著(P>0.05),与0.01%质量分数组差异显著(P<0.05)。随着培养基中的蛋黄粉质量分数的增加,斑马鱼高血脂的症状逐渐增加。0.50%的蛋黄粉质量分数造模效果最佳,但0.50%蛋黄粉质量分数时,已经超过斑马鱼幼苗的耐受度,斑马鱼死亡率较高,达50%;而在0.01%～0.10%蛋黄粉质量分数,死亡率均在20%±5%。综合分析比较得出,最佳的造模条件为0.10%的蛋黄粉质量分数。因此,选择含0.10%蛋黄粉的培养基进行造模。油红O染色可进一步验证造模是否成功,如图1(g)为不含蛋黄粉斑马鱼幼苗染色结果,未见到尾脂被染色;图1(h)为含0.01%的蛋黄粉斑马鱼幼苗染色,幼苗的尾脂被染色,整个尾脂都被油红O成功染色。油红O结果表明,造模成功的斑马鱼尾脂可以被染色,而未经蛋黄溶液培养的斑马鱼尾脂没有被染色。从组织化学和免疫荧光两个方面证明了斑马鱼高血脂模型的科学性与可行性。

注:*表示P<0.05,** 表示P<0.01,*** 表示P<0.001;下同。

2.2 丝素蛋白与辛伐他汀处理组结果的分析与比较

由图2的结果可以看出,高质量浓度(1.0 μg/mL)的丝素蛋白与高质量浓度的辛伐他汀(1.0 μg/mL)相比,荧光强度没有差异(P>0.05);丝素蛋白中质量浓度(0.5 μg/mL)与辛伐他汀中质量浓度(0.5 μg/mL)相比,荧光效果差异极显著(P<0.001);丝素蛋白低质量浓度(0.1 μg/mL)和辛伐他汀低质量浓度(0.1 μg/mL)相比差异极显著(P<0.001);两者的溶剂对照组没有差异(P>0.05)。比较分析可以得出,丝素蛋白在中质量浓度(0.5 μg/mL)和低质量浓度(0.1 μg/mL)具有更好的降血脂效果。整体趋势来看,随着丝素蛋白质量浓度和辛伐他汀质量浓度的提高,尾脂的荧光强度逐渐下降,斑马鱼血脂下降。实验结果表明,丝素蛋白可以通过浓度差进入到斑马鱼体内,通过血液循环发挥作用,丝素蛋白具有类似他汀类药物的降血脂作用。此外,对于幼年斑马鱼来说,主要靠吸收培养基中的营养物质来进行生长发育,丝素蛋白利用浓度差进入高血脂斑马鱼的血液循环中,降解为氨基酸,其中赖氨酸和蛋氨酸这类限制性氨基酸可以影响鱼类生长基因和相关蛋白质代谢,这类限制性氨基酸可以增强肝的代谢;丝素蛋白质量浓度越高,浓度差越大,进入血液循环的限制性氨基酸越多,肝的代谢得到增强,血液中的脂质水平下降,斑马鱼的尾脂荧光强度降低。而对于他汀类药物来说,其药理作用是抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)的作用,这是肝脏甲羟戊酸途径中胆固醇合成的关键酶,这种抑制作用只可以阻止新的胆固醇合成,一时间无法快速缓解高血脂斑马鱼血液中的脂质水平,随着他汀类药物质量浓度的提高,血液中没有了胆固醇的来源,可以通过循环将血液的胆固醇逐渐新陈代谢出去,从而导致血液中的脂质水平下降,这也可以解释为什么他汀类药物质量浓度越高,抑制效果越明显。综上,各个质量浓度的丝素蛋白均可以降低高血脂斑马鱼的高血脂水平。

图2 丝素蛋白和辛伐他汀处理组的结果比较

2.3 辛伐他汀处理组结果分析与比较

由图3的结果可以看出,与溶剂对照组荧光强度相比,高质量浓度(1.0 μg/mL)辛伐他汀药物处理的高血脂斑马鱼具有显著性差异(P<0.001);中质量浓度(0.5 μg/mL)和低质量浓度(0.1 μg/mL)差异不显著(P>0.05);其中低质量浓度(0.1 μg/mL)荧光强度有下降的趋势,但差异不显著。这种结果与他汀类药物的作用原理有关,在更换培养基之后,斑马鱼血液中的外源胆固醇不再增加,胆固醇主要来自体内,但是如果辛伐他汀的质量浓度过低,无法完全抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)肝脏甲羟戊酸途径中胆固醇合成的关键酶,胆固醇仍然被加工出来,因此斑马鱼中的尾脂荧光水平没有得到有效降低。图3(b)为图3(a)数值代入式(1)的结果,也证实了辛伐他汀中质量浓度(0.5 μg/mL)和低质量浓度(0.1 μg/mL)有降低血脂水平的效果,但是只有高质量浓度的辛伐他汀(1.0 μg/mL)可以高度抑制3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)肝脏甲羟戊酸途径中胆固醇合成的关键酶。高质量浓度的辛伐他汀药物虽然可以降低血脂,但是质量浓度过高,可能会对肝功能造成不可逆的损伤,因此他汀类药物本身具有一定的局限性。

图3 辛伐他汀处理结果分析

2.4 丝素蛋白处理组结果分析与比较

由图4(a)的结果表明,与阳性对照组(0.05 μg/mL)辛伐他汀相比,丝素蛋白在高质量浓度组(1.0 μg/mL)和中质量浓度组(0.5 μg/mL)均差异极显著(P<0.001);低质量浓度(0.1 μg/mL)差异不显著(P>0.05);而图4(b)血脂降低率则表明,与丝素蛋白低质量浓度(0.1 μg/mL)相比,高质量浓度(1.0 μg/mL)和中质量浓度(0.5 μg/mL)差异极显著(P<0.001),丝素蛋白质量浓度对降血脂效果影响较大。丝素蛋白通过浓度差进入到斑马鱼的血液循环中,之后在血液循环的作用下降低血液中的胆固醇含量,从而降低尾脂的荧光强度。质量浓度实验则表明,丝素蛋白也需要一定的质量浓度才可以发挥它的作用,质量浓度越高,降血脂效果越显著,但是丝素蛋白中质量浓度(0.5 μg/mL)与高质量浓度(1.0 μg/mL)相比,降血脂的效果差异不显著(P>0.05)。综上,丝素蛋白对降血脂的提升效果最好是在0.5～1.0 μg/mL。

图4 丝素蛋白处理结果

3 结 论

本文提供了一种可信度高的斑马鱼高血脂模型,操作简便、过程简单,可以用来筛选其他高血脂药物;同时探究了丝素蛋白对高血脂斑马鱼降血脂的效果,主要有以下结论。

1) 利用含0.1%蛋黄粉的培养基培养斑马鱼幼苗48 h就可以得到斑马鱼高血脂模型,模型可用免疫荧光和油红O方法检测。

2) 采用市面上成熟的降血脂药物辛伐他汀进一步验证了高血脂斑马鱼可以通过尾脂的荧光染色显示降血脂效果。

3) 各个质量浓度的丝素蛋白均有降血脂的效果,其中高质量浓度(1.0 μg/mL)降血脂效果最好。

4) 与辛伐他汀相比,丝素蛋白在低质量浓度(0.1 μg/mL)和中质量浓度(0.5 μg/mL)的降血脂效果更好。

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