响应面法优化米槁叶片黄酮的提取工艺*

魏 晴，郑 双，何兰凤，梁珊珊，孙庆文

（贵州中医药大学a.药学院；b.大果木姜子研究中心；c.植物多糖研究中心，贵州 贵阳 550025）

米槁（Cinnamomum migao H.W.Li）为樟科樟属植物，多生长于我国西南地区，以贵州为主。其干燥成熟果实为大果木姜子，是贵州十大苗药之一。大果木姜子具有温中散寒，理气止痛的作用。通常人们把它当作治疗胸腹疼痛等疾病的药物[1]。近些年来对大果木姜子的化学成分和药理学方面研究比较深入[2-4]。此外，研究发现米槁除了果实可以作为药用部位，米槁叶片、种子也可作为其药用部位。但对于叶片和种子这两个新药用部位的研究几乎是一片空白，前期研究发现米槁叶片有很好的抗氧化作用，进一步发现醇提物效果更好，因此，推测米槁叶片发挥抗氧化的成分可能为黄酮组分。黄酮是有效的抗氧化剂，可保护植物免受不利环境条件的影响，因此，现在被用于大量流行病学和实验研究，以评估它们在多种急性和慢性人类疾病中可能产生的有益作用[5,6]。此外，体外和体内研究表明，黄酮类化合物具有抗炎、免疫调节和强大的抗癌活性[7-11]。为进一步使米槁叶片发挥更好的抗氧化作用，本课题以米槁叶片中黄酮为研究对象，以提取时间、液料比、超声功率、乙醇浓度、提取温度为考察因素，以黄酮含量为指标性成分评价米槁叶片黄酮的最佳提取工艺。

1 实验部分

1.1 材料与仪器

米槁叶片采摘自贵州省罗甸县，经贵州中医药大学药学院孙庆文教授鉴定为樟科樟属植物米槁Cinnamomum migao H.W.Li的叶片。

芦丁标准品（纯度＞98%北京万佳标准物质研发中心）；乙醇（纯度＞98%南京化学试剂股份有限公司）；DPPH（纯度＞98%美国Sigma-Aldrich公司），其它化学试剂均为分析纯。

UV7型紫外可见分光光度计（梅特勒-托利多国际贸易上海有限公司）；HH-600型恒温水浴（上海一科仪器有限公司）；FB224型电子分析天平（上海恒平科学仪器有限公司）；KQ-500DE型超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 样品的前处理 将新鲜的米槁叶片置于阴凉处晾干，除去枝梗和杂质，粉碎，然后过40目筛，即得米槁叶片粉末。

1.2.2 超声提取单因素试验 影响黄酮含量的因素主要包括提取时间、超声温度、功率、液料比、乙醇浓度等。因此，分别对以上单因素进行考察，筛选出对黄酮含量影响最大的因素。

1.2.2.1 提取时间对黄酮含量的影响 分别称取米槁叶片粉末5g，按照液料比20∶1（mL∶g），超声功率为80W，乙醇浓度为70%，超声温度为60℃，提取时间分别为25、30、35、40、45min进行提取，考察不同提取时间对黄酮含量的影响。

1.2.2.2 超声功率对黄酮含量的影响 分别称取米槁叶片粉末5g，按照液料比20∶1（mL∶g），提取时间30min，乙醇浓度为70%，超声温度为60℃，超声功率分别为20、40、60、80、100W，考察不同超声功率对黄酮含量的影响。

1.2.2.3 液料比对黄酮含量的影响 分别称取米槁叶片粉末5g，按照提取时间30min，超声功率80W，乙醇浓度为70%，超声温度为60℃，液料比分别为10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1（mL∶g），考察不同液料比对黄酮含量的影响。

1.2.2.4 乙醇浓度对黄酮含量的影响 分别称取米槁叶片粉末5g，按照液料比20∶1（mL∶g），提取时间30min，超声功率为80W，超声温度为60℃，乙醇浓度分别为50%、60%、70%、80%、90%进行提取，考察不同乙醇浓度对黄酮含量的影响。

1.2.2.5 超声温度对黄酮含量的影响 分别称取米槁叶片粉末5g，按照液料比20∶1（mL∶g），提取时间30min，超声功率为80W，乙醇浓度为70%，超声温度分别为40、50、60、70、80℃，考察不同超声温度对黄酮含量的影响。

1.2.3 总黄酮含量测定

1.2.3.1 总黄酮标准曲线的绘制 标准曲线的绘制参考文献[12，13]。得到线性回归方程为：

1.2.3.2 样品总黄酮含量的测定 测定方法参考文献[14，15]。

总黄酮含量/%=C×D×V/（W×1000）×100%。式中 C：样品中总黄酮浓度，mg·mL-1；D：样品溶液稀释倍数；V：供试品溶液体积，mL；W：样品的质量，g。

1.2.4 响应面法优化超声提取工艺参数 根据单因素试验结果，选取对实验影响较大即提取时间、液料比、超声功率,以黄酮含量为评价指标，采用三因素三水平响应面法对试验进行设计，设计因素与水平见表1。

表1 试验因素水平及编码Tab.1 Test factor levels and codes

2 结果与讨论

2.1 单因素实验结果

2.1.1 不同提取时间的影响

图1为提取时间对米槁叶片黄酮含量的影响。

图1 提取时间对米槁叶片黄酮含量的影响Fig.1 Effect of extraction time on flavonoid content of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由图1可知，在固定其他条件下，提取时间在25~40min范围内，随着提取时间的延长，黄酮含量越高。提取时间为40min时，黄酮含量达到最高值。45min时黄酮含量略有下降。原因可能是，随着提取时间的增加，使得组织细胞破碎程度增加，其他易溶于乙醇的成分被提取出来，降低了黄酮的含量。

2.1.2 不同提取功率的影响

图2为提取功率对米槁叶片黄酮含量的影响。

图2 提取功率对米槁叶片黄酮含量的影响Fig.2 Effect of extraction power on flavonoid content of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由图2可知，在固定其他条件下，提取功率在20~80W范围内，随着提取功率增加，黄酮含量升高。提取功率为80W时，黄酮含量达到最高值。当提取功率大于80W后，黄酮含量略有下降，原因可能是，由于超声功率过高，使得溶剂温度升高，破坏了米槁黄酮结构，从而使黄酮含量下降。

2.1.3 不同液料比的影响

图3为液料比对米槁叶片黄酮含量的影响。

图3 液料比对米槁叶片黄酮含量的影响Fig.3 Effect of liquid-to-material ratio on flavonoid content of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由图3可知，在固定其他条件下，液料比在10∶1~30∶1（mL∶g）范围内，随着提取时间增长，黄酮含量升高。液料比在30∶1（mL∶g）时黄酮含量达到最高值。超过30∶1（mL∶g）后黄酮含量略有下降，可能的原因是，随着溶剂含量增加，其他易溶于乙醇的成分也被提取出来，从而使黄酮含量降低。

2.1.4 不同乙醇浓度的影响

图4为乙醇浓度对米槁叶片黄酮含量的影响。

图4 乙醇浓度对米槁叶片黄酮含量的影响Fig.4 Effect of ethanol concentration on flavonoid content of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由图4可知，固定其他条件下，在乙醇浓度为50%~70%范围内，随着乙醇浓度增加，黄酮含量升高。乙醇浓度为70%时，黄酮含量达到最高值。当乙醇浓度升高，黄酮含量显著下降。原因可能是，高浓度的乙醇会增加溶液的溶解度，使其他可溶性杂质被提取出来，使黄酮含量降低。

2.1.5 不同提取温度的影响

图5为提取功率对米槁叶片黄酮含量的影响。

图5 提取温度对米槁叶片黄酮含量的影响Fig.5 Effect of extraction temperature on flavonoid content of Cinnamomum migao H.W.Li leaves

由图5可知，固定其他条件下，温度在40~60℃范围内，随着提取温度升高，黄酮含量升高。提取温度在60℃时，黄酮含量达到最高值。超过60℃后，黄酮含量显著下降。原因可能是，随着温度升高，使得部分黄酮类化合物结构改变，苯环被破坏，最终导致黄酮含量降低。

2.2 响应面法优化超声提取工艺参数结果

2.2.1 试验设计及结果 根据单因素试验结果，选取对实验影响较大即提取时间、液料比、超声功率,以黄酮含量为评价指标，采用三因素三水平Box-Behnken响应面法对试验进行设计，Box-Behnken响应面试验方案设计及结果见表2。

表2 响应面设计及结果Tab.2 Response surface design and results

2.2.2 建立响应面模型拟合及方差分析 采用Design-Expert 8.0.6.1软件，以提取时间、液料比、超声功率为考察因素，以黄酮含量为评价指标，对实验结果进行回归方程拟合得到回归方程为：

黄酮含量%=1.03-0.05A+0.022B+5.75E-003C-0.025AB+0.021AC+9.5E-003BC-0.17A2-0.20B2-0.22C2（A、B、C分别代表提取时间、超声功率、液料比），并对响应面模型进行方差分析及显著性检验，结果见表3。

由表3可知，该模型P小于0.0001，说明此模型差异具有统计学意义，矫正系数R2adj=0.9923，预测复相关系数R2=0.9966，预测相关系数R2（Pred）=0.9560与预测复相关系数接近，说明偏差在合理范围内，实际值和预测值拟合度比较好。失拟项F=1.519E-003，P=0.0765，大于0.05不显著，说明选择的模型对该试验的拟合度较好。变异系数C.V.%为2.19%，说明该模型相关性好，可用该拟合回归方程对不同条件下米槁叶片黄酮的最佳得率进行分析。提取时间对米槁叶片黄酮得率影响较大，其次为超声功率。由表3还可以看出，A、B、A2、B2、C2的P值小于0.01，AB、AC的P值小于0.05，以上因素对黄酮得率的影响显著，其他因素对黄酮得率的影响不显著。由F值可知，3个因素对米槁叶片黄酮得率的影响程度由大到小顺序为：提取时间＞超声功率＞液料比。

表3 方差分析及显著性结果Tab.3 Analysis of variance and significance results

2.2.3 响应面参数优化、预测与分析 采用Design-Expert 8.0.6.1软件做超声提取工艺参数的Box-Behnken响应面3D图及等高线分析图，见图6。

由图6可知，等高线越密集，中间形状呈椭圆形或圆形，响应曲面越陡峭，说明该因素变化对响应值影响大，且两因素之间的交互作用大，反之表明两因素之间的交互作用对响应值的影响较小。通过其拟合图形分析提取时间、超声功率、液料比对黄酮含量的影响，结合表3的P值和图6可知，A、B、A2、B2、C2的P值小于0.01，AB、AC的P值小于0.05，A和B对响应面弧面影响较大。通过求解回归模型方程得到最佳超声提取工艺参数为：提取时间39.87min、超声功率为78.89W，液料比为29.72（mL∶g），黄酮含量为1.04%。

图6 超声提取工艺参数的Box-Behnken响应面3D图及等高线分析图Fig.6 Box-Behnken response surface 3D diagram and contour analysis diagram of ultrasonic extraction process parameters

2.2.4 工艺验证 为检验试验方法的可靠性，将对优化后的工艺参数进行3次平行试验，同时考虑到优化实际操作的可行性，最终将实验参数设定为：提取时间40min、超声功率80W、液料比30（mg∶L），得到的黄酮含量为1.05%，与预测值1.04%相比偏差为0.01%，说明本实验所建模型预测性较好且稳定。故响应面值法优化叶片黄酮超声提取工艺参数的方法可行且稳定。

3 结论

为了更好提取出米槁叶片中黄酮，本实验以黄酮含量为评价指标，采用响应面法对超声提取工艺的参数进行优化，得到最佳提取工艺参数为提取时间40min、超声功率为80W、液料比为30（mL∶g），得到黄酮含量为1.05%。