拮抗剂方案取卵后雌激素下降幅度对新鲜胚胎移植结局的影响

周羽西，张娟，张娟娟，凌秀凤，赵纯

体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET）刺激周期的内分泌学已被广泛研究，研究者们都在寻找能确定IVF-ET后成功妊娠的潜在预测因素。近年来备受关注的能够预测IVF-ET后妊娠结局的因素包括人绒毛膜促性腺激素（human chorionic gonadotropin，hCG）日孕酮水平[1-2]、hCG日雌二醇（estradiol，E2）水平[3-4]以及hCG日至取卵后、胚胎移植日的E2变化水平[5-6]等。关于取卵前后E2下降幅度对IVF-ET妊娠结局影响的研究大多集中在长方案上，目前尚无拮抗剂方案取卵前后E2下降幅度对IVF-ET妊娠结局影响的报道。本研究探究拮抗剂方案取卵后48 h较取卵前24 h E2下降幅度对妊娠结局的影响，旨在优化ET方案，改善拮抗剂方案新鲜胚胎移植的临床结局。

1 对象与方法

1.1 研究对象回顾性分析2017年1月—2021年3月于南京医科大学附属妇产医院生殖医学中心行IVF-ET患者的临床资料，最终纳入413个周期。纳入标准：①年龄20～40岁；②基础卵泡刺激素（follicle-stimulating hormone，FSH）＜15 U/L；③采用拮抗剂方案进行控制性超促排卵（controlled ovarian hyperstimulation，COH）；④新鲜胚胎移植。排除标准：①输卵管积水；②Ⅲ～Ⅳ期子宫内膜异位症；③子宫畸形；④hCG日子宫内膜厚度＜7 mm；⑤取卵后第3天无优质胚胎。

1.2 方法

1.2.1 COH所有患者均采用拮抗剂灵活方案进行COH，自月经第2～3天开始使用外源性促性腺激素（gonadotropin，Gn），即重组人FSH（果纳芬，默克雪兰诺有限公司）或人绝经期促性腺激素（human menopausal gonadotropin，HMG，注射用尿促性素，丽珠集团丽珠制药厂），根据患者的年龄、基础FSH、体质量指数（body mass index，BMI）和窦卵泡计数（antral follicle count，AFC）等决定Gn起始剂量。Gn使用至少5 d后根据超声检查和血清E2水平调整Gn剂量，当达以下标准[7]：①优势卵泡平均直径＞12 mm且血清E2＞1 098 pmol/L或卵泡平均直径≥14 mm；②黄体生成素（luteinizing hormone，LH）＞10 U/L和（或）优势卵泡平均直径＞12 mm和（或）血清E2＞549 pmol/L，开始应用促性腺激素释放激素拮抗剂（gonadotrophin releasing hormone antagonist，GnRHA，思则凯，Pierre Fabre Medicament Production-Aquitaine Pharm International）。当有≥3个平均直径≥17 mm的卵泡时，结合血E2、LH和孕酮水平，使用10 000 IU hCG触发卵母细胞成熟，36 h后行穿刺取卵术。取卵后培养卵子4～6 h，根据男方精子情况选择IVF或卵细胞质内单精子注射（intracytoplasmic sperm injection，ICSI），取卵后第3天行卵裂期ET术。自取卵日起，口服地屈孕酮（达芙通，荷兰苏威制药公司）30 mg/d或阴道用雪诺同凝胶（雪诺同，英国Fleet Laboratories Limited）90 mg/d进行黄体支持。

1.2.2 激素测定罗氏化学发光分析仪行FSH、LH、E2和孕酮水平检测，酶联免疫吸附法检测抗苗勒管激素（anti-Müllerian hormone，AMH）水平。所有患者于月经周期第2天采集2 mL外周静脉血进行基础FSH、LH和E2检测，并于Gn启动日、拮抗剂添加日及hCG日测定血清LH、E2及孕酮水平，注射hCG后12 h（取卵前24 h）及取卵后48 h检测E2水平。

1.2.3 受精观察和胚胎评价受精后16 h观察原核形成，正常受精卵为两个原核（two pronuclear，2PN）受精卵。培养72 h后观察胚胎，卵裂期胚胎评价采用Peter评分标准[8]，优质胚胎为：卵裂球大小较为均匀，细胞数≥7个，形状规则，细胞透亮，碎片率＜20%。

1.2.4 妊娠结局判断ET后2周检测血清β-hCG水平，若β-hCG＞50 U/L则继续黄体支持至妊娠10周后，逐渐减药直至妊娠12周停用黄体支持。ET后4周经阴道B超见宫内妊娠囊诊断为临床妊娠，妊娠12周内流产为早期流产，妊娠满12周不足28周流产为晚期流产。活产为妊娠28周后出生的活产婴儿。

1.2.5 观察指标①一般情况：记录患者的年龄、BMI、基础FSH、基础LH、基础E2、AMH、AFC、不孕原因、不孕类型、不孕时间、移植胚胎数和授精方式等。②COH结果：Gn启动剂量、Gn使用时间、Gn总量、GnRHA启动剂量、GnRHA使用时间和GnRHA总量，hCG日LH、E2、孕酮水平和子宫内膜厚度，取卵前24 h及取卵后48 h的E2水平。③胚胎参数：获卵数、成熟卵母细胞（metaphaseⅡ，MⅡ）数、2PN数、受精率（总2PN数/总MⅡ数×100%）、可利用胚胎数、优质胚胎数、优胚率（优质胚胎数/可利用胚胎数×100%）。④妊娠结局：主要观察指标是活产率（活产周期数/总移植周期数×100%），次要观察指标包括种植率（着床胚胎总数/总移植胚胎数×100%）、临床妊娠率（临床妊娠周期数/总移植周期数×100%）、早期流产率（早期流产周期数/临床妊娠周期数×100%）、晚期流产率（晚期流产周期数/临床妊娠周期数×100%）和异位妊娠率（异位妊娠周期数/临床妊娠周期数×100%）。

1.3 分组情况根据取卵后48 h较取卵前24 h E2降低幅度对患者进行分组，E2降低幅度=（取卵前24 h E2－取卵后48 h E2）/取卵前24 h E2，经计算E2降低幅度范围为18.7%～97.7%，根据下降幅度范围的四分位数分为4组。A组（104个周期）：降低幅度在总体降低范围的0～25.0%，即在18.7%～64.5%之间；B组（103个周期）：降低幅度在总体降低范围的25.1%～50.0%，即在64.6%～71.2%之间；C组（103个周期）：降低幅度在总体降低范围的50.1%～75.0%，即在71.3%～76.4%之间；D组（103个周期）：降低幅度在总体降低范围的75.1%～100.0%，即在76.5%～97.7%之间。

1.4 统计学方法使用SPSS 26.0软件对所有数据进行统计分析。符合正态分布的定量资料用均数±标准差（）表示，组间比较采用单因素方差分析，不符合正态分布的定量资料用中位数和四分位数[M（P25，P75）]表示，组间比较采用Kruskal-Wallis检验；定性资料用百分比表示，4组间比较和组间两两比较采用χ2检验。采用Logistic回归分析E2下降幅度与活产率的相关性，并控制潜在混杂因素，关联强度采用比值比（odds ratios，OR）和95%置信区间（confidence interval，CI）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况比较4组患者BMI、基础FSH、基础LH、AMH和AFC比较，差异有统计学意义（均P＜0.05），年龄、基础E2、不孕原因、不孕类型、不孕时间、移植胚胎数和授精方式比较，差异无统计学意义（均P＞0.05）。见表1。

表1 患者一般情况比较

2.2 COH及胚胎参数比较4组患者Gn总量、GnRHA使用时间和hCG日E2水平比较，差异有统计学意义（均P＜0.05），Gn启动剂量、Gn使用时间、GnRHA启动剂量、GnRHA总量、hCG日LH和孕酮水平、hCG日内膜厚度、获卵数、MⅡ卵子数、2PN数、受精率、可利用胚胎数、优质胚胎数和优质胚胎率比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表2。

表2 4组患者促排卵及胚胎实验室参数比较

2.3 妊娠结局比较4组患者种植率、临床妊娠率和活产率比较，差异有统计学意义（均P＜0.05），两两比较之后，其中A组活产率大于D组，B组活产率大于C组及D组，A组、B组种植率大于D组，差异均有统计学意义（均P＜0.008 3）。而4组患者的早期流产率、晚期流产率和异位妊娠率比较，差异均无统计学意义（均P＞0.05）。见表3。

表3 4组患者妊娠结局比较 [%（n/n）]

2.4 二元Logistic回归分析以活产为因变量（活产=1，未活产=0）进行Logistic回归分析，校正BMI、基础FSH、基础LH、AMH、AFC、Gn总量、GnRHA使用时间、hCG日E2等差异因素后，结果显示AFC影响患者活产率（OR=1.070，95%CI：1.004～1.141，P=0.037），提示AFC较多的周期的活产率高于AFC较少的周期。A、B组活产率均显著高于D组（OR=2.079，95%CI：1.138～3.799，P=0.017；OR=2.187，95%CI：1.213～3.944，P=0.009），提示活产率与E2降低幅度有关，E2降低幅度小是活产的保护因素。见表4。

表4 以活产为因变量的二元Logistic回归分析

3 讨论

本研究结果表明，在拮抗剂方案COH新鲜胚胎移植周期中，活产率会随着取卵前后E2变化幅度的增加而降低。在COH过程中，血清E2水平是评估卵巢对Gn反应的一个重要指标。随着卵泡发育，E2水平不断上升，可达生理状态的10倍以上，并在取卵前达到高峰，取卵后由于大量颗粒细胞丢失导致雌激素水平急剧下降，这就使得在促排卵过程中E2呈现曲线形的变化，单纯一个时间点的E2水平可能不能反应整体情况[9]。多年来hCG日E2水平与新鲜周期妊娠结局之间的关系一直是学者争论的焦点，既往研究对于hCG日E2水平对妊娠结局的影响观点不一，部分研究认为hCG日过高[4]及过低[10]的E2水平都能影响子宫内膜容受性，新鲜胚胎移植周期hCG日最佳的血清E2浓度为3 670.00～11 553.16 pmol/L[11]，但也有数据表明hCG日的E2水平不会影响胚胎种植率、临床妊娠率和活产率[12]。关于E2水平变化对IVF妊娠结局的研究主要集中在长方案，研究发现长方案hCG日与取卵后48 h E2下降幅度不影响胚胎质量，却对子宫内膜容受性、胚胎种植率及妊娠率有负面影响[6，13]。刘丽等[14]认为胚胎移植日E2较hCG日E2下降幅度超过40%时，妊娠率显著降低。目前，拮抗剂方案hCG日E2水平与妊娠结局的关系尚无定论。严思思等[3]认为拮抗剂方案hCG日E2水平可作为妊娠率的预测指标，另有学者则认为hCG日E2水平与妊娠率和活产率无关[4，15]。在自然月经周期中，血清E2水平随着卵泡生长而增加，通常在LH峰后下降。相反，在拮抗剂IVF周期中，GnRHA可能导致LH峰提前。虽然密切监测血清E2水平是评估卵巢反应的主要方式之一，但鲜有研究关注取卵前后E2水平变化的预测价值。为了探究拮抗剂方案取卵前后E2水平变化对新鲜周期妊娠结局的影响，本研究对取卵后48 h较取卵前24 h E2降低幅度与妊娠结局的关系进行了分析，结果显示E2降低幅度对卵母细胞和胚胎的质量没有显著的负面影响，但E2降低幅度大，尤其超过整体下降幅度50%以上者的妊娠结局包括种植率、临床妊娠率和活产率均显著低于降低幅度较小的患者。

由于GnRHA能够迅速抑制LH的脉冲分泌，使LH水平降低，较长方案有更早、更强的溶黄体作用，由黄体产生的雌激素和孕酮水平较低，新鲜胚胎移植时常需更充分的黄体支持，但是否需要补充雌激素尚无定论。有研究表明，拮抗剂方案自取卵日或移植日开始补充不同剂量的E2（2、4、6 mg/d）均不能改善新鲜胚胎移植的妊娠结局[16-18]。一项随机对照研究也证实，对hCG日E2/获卵数＜100的患者补充E2（4 mg/d）并不能改善临床妊娠率。取卵后E2水平快速下降，使得分泌期子宫内膜发育延迟，内膜发育与胚胎发育不同步，最终导致胚胎种植率降低。Kwon等[19]报道了在拮抗剂灵活方案IVF周期中口服戊酸雌二醇（4 mg/d）可提高胚胎种植率和降低阴道出血率，但不能提高临床妊娠率。本研究的结果表明，取卵后48 h较取卵前24 h E2下降幅度大于整体下降幅度50%以上时活产率明显降低，具体机制仍不明确。对该类患者是否应选择全胚冷冻，或行新鲜胚胎移植是否需要补充E2加强黄体支持，以改善妊娠结局，尚待大样本前瞻性研究进一步证实。

AFC是早卵泡期经阴道B超测量直径为2～8 mm的卵泡数，AFC与年龄和卵巢储备功能密切相关，能预测卵巢反应性[20]。在本研究中，AFC与拮抗剂方案新鲜胚胎移植结局独立相关。

综上所述，在拮抗剂方案新鲜移植周期中，取卵前后E2下降幅度的不同将影响妊娠结局。本研究的局限性在于尽管通过严格的纳入排除标准、Logistic回归分析来控制混杂因素，但仍无法避免回顾性研究本身可能存在的选择性偏差，此外，本研究没有观察囊胚移植周期是否仍然适用上述结论。未来仍需大样本、高质量的研究验证该结论，以期以此为切入点，对相应人群的妊娠结局进行预测，调整移植方案，改善生殖结局。