黄芪汤对肝硬化门静脉高压症大鼠门静脉压力的影响及作用机制研究

王浩艺，黄广建，刘从进，陈高峰，陈天阳，成扬，3

1.上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所，上海 201203；2.复旦大学附属华山医院，上海 200040；3.上海中医药大学肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海 201203

肝硬化门静脉高压症（cirrhotic portal hypertension，CPH）是指在肝硬化基础上，门静脉系统血流受阻或血流量增加，导致门静脉及其属支压力升高，并由此引起的一系列临床综合征，其中上消化道出血是CPH最主要的并发症。目前西药治疗存在诸多禁忌症及耐药性等问题，外科治疗也存在风险，无法解决引起CPH的根本原因——肝纤维化，相反可能因肝脏血流量减少不利于肝损伤的修复。相关Meta分析显示，中医药在治疗肝硬化患者门静脉高压症、改善血流动力学方面优于普萘洛尔，针对CPH当前治疗存在的困境，从传统中医药宝库中挖掘防治措施十分必要。

基于肝硬化“虚损生积”理论，本课题组前期研究发现，黄芪汤可有效改善乙肝后肝硬化患者肝功能，减少门静脉内径，改善食管胃底静脉曲张程度，减小血清血管内皮生长因子（VEGF）含量。但其具体作用机制尚未明确。为此，本研究采用胆管结扎术制备CPH大鼠模型，基于VEGF及其下游信号通路观察黄芪汤对模型大鼠门静脉压力的影响，探讨其作用机制。

1 实验材料

1.1 动物

SPF级雄性Wistar大鼠50只，体质量（180±10）g，购自上海斯莱克实验动物有限公司，动物生产许可证号SCX（沪）2017-0005。饲养于上海中医药大学动物实验中心清洁级动物房，温度（20±2）℃、相对湿度50%～60%环境，12 h光照周期，自由进食饮水。适应性饲养1周后进行实验。本研究经上海中医药大学伦理委员会批准（PZSHUTCM2019041835）。

1.2 药物及制备

黄芪汤（炙黄芪30 g，炙甘草5 g）颗粒，江苏江阴天江药业有限公司提供（批号1212353），1.2 g黄芪汤颗粒相当于黄芪原药材6 g、炙甘草原药材1 g。实验时用蒸馏水配制成浓度为35、70、140 mg/mL，4 ℃保存备用。

1.3 主要试剂与仪器

大鼠VEGF ELISA检测试剂盒，上海晶抗生物公司，货号JLC2293；DAB显色试剂盒，南京建成生物工程研究所，货号W026-1-2；血管性血友病因子（vWF）抗体、CD31 抗体、VEGF 抗体，美国Proteintech 公司，货号分别为27186-1-AP、66065-2-Ig、66828-1-Ig；GAPDH 抗体、磷脂酰肌醇3-激酶（PI3K）抗体、p-PI3K抗体、蛋白激酶B（Akt）抗体、p-Akt抗体、内皮型一氧化氮合酶（eNOS）抗体，美国Cell Signaling Technology公司，货号分别为5174、4249、4228、4685、4060、32027。Power Lab生理数据处理和分析系统，澳大利亚ADI公司；SCN400型数字化病理切片扫描仪，德国Leica公司；Excelsior ES全自动组织脱水机，美国Thermo Fisher Scientific 公司；HD-330型烤片机，天津市惠达实验仪器有限公司；DENLEY DRAGON Wellscan MK3酶标仪，美国Thermo公司；Wellwash 4 MK2洗板机，美国Thermo公司；Odyssey红外激光扫描成像系统，美国Li-Cor公司。

2 实验方法

2.1 造模

将50只大鼠随机分为假手术组（10只）和造模组（40只）。参考文献[8]采用胆管结扎术制备CPH大鼠模型：称量大鼠体质量，3%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉（2 mL/kg），仰卧位固定于实验台，皮肤消毒，于剑突下沿腹正中行一约3 cm切口，暴露肝脏，分离胆总管，手术缝线双重结扎后离断，连续缝合肌层关腹。假手术组开腹后仅牵引胆总管但不做离断结扎。

2.2 分组及给药

大鼠行结扎术后禁食12 h，禁水4 h。1周后将造模大鼠随机分为模型组和黄芪汤低、中、高剂量组，黄芪汤低、中、高剂量组分别予黄芪汤0.35、0.70、1.40 g/kg灌胃（相当于60 kg成人临床用量的3.5、7、14倍），灌胃体积1 mL/100 g，假手术组和模型组予等体积生理盐水灌胃，每日1次，每周灌胃6 d，连续4周。

2.3 门静脉压力测定

给药结束后，3%戊巴比妥钠腹腔注射（2 mL/kg）麻醉大鼠，将大鼠固定于37 ℃保温玻璃板上，沿腹壁正中剪一2 cm切口，打开腹腔，暴露门静脉主干，分离肠系膜上静脉，将远离门静脉的一端结扎后剪一“V”形切口，插入PE-10管至门静脉，接通压力换能器，检测门静脉压力。

2.4 取材

门静脉压力测定完毕后，下腔静脉取血，室温静置2 h，3 000 r/min离心15 min，分离血清，置于-80 ℃保存备用。摘取肝脏，切取肝右叶同一位置组织（约1.0 cm×0.8 cm×0.3 cm），置于10%福尔马林溶液中固定，用于组织病理学检测。称取100 mg 肝组织，置于-80 ℃保存，用于Western blot检测。

2.5 ELISA检测

采用ELISA检测血清VEGF含量，严格按试剂盒说明书操作。

2.6 天狼猩红染色

大鼠肝组织经10%福尔马林溶液固定后，经组织脱水机脱水，石蜡包埋，切片（厚约5 μm），天狼猩红染色观察肝组织纤维化程度，以数字化病理切片扫描仪进行扫描分析，采用Image Scope软件计算胶原染色面积。

2.7 免疫组化染色

石蜡切片65 ℃烤片60 min，二甲苯脱蜡，梯度乙醇水化；置于枸橼酸缓冲液中，微波炉100 ℃、8 min，60 ℃、25 min进行抗原修复，自然冷却至室温，PBS洗3次，3%HO灭活内源性过氧化物酶，滴加vWF一抗（1∶200）、CD31一抗（1∶600），4 ℃孵育过夜；次日37 ℃水浴箱复温45 min，滴加相应二抗（1∶10 000），37 ℃孵育20 min；DAB避光显色3 min，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，封片，光学显微镜下观察，以黄色或棕黄色颗粒为阳性表达，采用Image J软件计算阳性表达的平均光密度。

2.8 Western blot检测

取100 mg肝组织加入1 mL裂解液，高速分散机进行匀浆，冰上静置30 min，4 ℃、12 000×离心15 min，收集上清液，采用BCA法测定蛋白浓度，吸取30 μg蛋白置于10%SDS聚丙烯酰胺凝胶，电泳分离后，半干法转移到硝酸纤维素膜上，Odyssey缓冲液封闭1 h，加入VEGF一抗（1∶1 000）、p-PI3K一抗（1∶1 000）、PI3K 一抗（1∶1 000）、p-Akt一抗（1∶2 000）、Akt一抗（1∶1 000）、eNOS一抗（1∶1 000）、GAPDH一抗（1∶5 000），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3次，加入相应二抗（1∶10 000），室温孵育1 h，Odyssey红外激光扫描成像系统扫描并分析，计算目的蛋白与内参蛋白的灰度值比值。

3 统计学方法

4 结果

4.1 黄芪汤对模型大鼠门静脉压力的影响

实验期间，模型组大鼠死亡2只、黄芪汤低剂量组死亡1只，其余各组大鼠无死亡。与假手术组比较，模型组大鼠门静脉压力显著升高（＜0.01）；与模型组比较，黄芪汤中、高剂量组大鼠门静脉压力显著降低（＜0.05）。结果见表1。

表1 各组大鼠门静脉压力比较（，mm Hg）

4.2 黄芪汤对模型大鼠血清血管内皮生长因子含量的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清VEGF含量显著增加，差异有统计学意义（＜0.01）；与模型组比较，黄芪汤各剂量组大鼠血清VEGF含量显著减少，差异有统计学意义（＜0.05），以黄芪汤高剂量组下降最显著（＜0.05）。见表2。

表2 各组大鼠血清VEGF含量比较（，pg/mL）

4.3 黄芪汤对模型大鼠肝组织病理形态的影响

假手术组大鼠肝组织仅汇管区和中央静脉周围有极少量阳性染色；与假手术组比较，模型组大鼠肝组织胶原染色面积显著增加（＜0.01），以汇管区为中心向肝实质放射状延伸，有假小叶形成；与模型组比较，黄芪汤各剂量组大鼠肝组织胶原染色面积显著减少（＜0.05），纤维间隔变窄变细，以黄芪汤高剂量组效果最为明显（＜0.05）。见表3、图1。

图1 各组大鼠肝组织形态（天狼猩红染色，×100）

表3 各组大鼠肝组织胶原染色面积比较（，%）

4.4 黄芪汤对模型大鼠肝组织血管性血友病因子、CD31表达的影响

vWF和CD31是肝硬化肝窦毛细血管化的重要分子指标。与假手术组比较，模型组大鼠肝组织vWF、CD31表达显著升高（＜0.05），主要表达在增生胆管周围，小叶中央静脉周围、汇管区；与模型组比较，黄芪汤各剂量组大鼠肝组织vWF、CD31阳性表达显著降低（＜0.05），其中以黄芪汤高剂量组效果最明显（＜0.05）。见图2、图3、表4。

表4 各组大鼠肝组织vWF、CD31阳性表达比较（）

图2 各组大鼠肝组织vWF阳性表达（免疫组化染色，×100）

图3 各组大鼠肝组织CD31阳性表达（免疫组化染色，×100）

4.5 黄芪汤对模型大鼠肝组织VEGF/PI3K/Akt/eNOS信号通路相关蛋白表达的影响

与假手术组比较，模型组大鼠肝组织VEGF、eNOS蛋白表达显著升高，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值显著增加（＜0.01）；与模型组比较，黄芪汤各剂量组大鼠肝组织VEGF、eNOS蛋白表达显著降低，p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值显著降低，且黄芪汤高剂量组效果最明显（＜0.05）。见图4、表5。

图4 各组大鼠肝组织VEGF、PI3K、Akt、eNOS蛋白免疫印迹

表5 各组大鼠肝组织VEGF、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、eNOS蛋白表达比较（）

5 讨论

结合症状体征，CPH可属中医学“积病”“臌胀”等范畴，张景岳强调“虚弱失调之人，多有积病”（《景岳全书·积聚》），李中梓指出“积之成者，正气之不足也，而后邪气居之”（《医宗必读》）。黄元御认为，臌胀之根源在于“中气败坏，水不化气而泛滥于上”。黄芪汤出自北宋《太平惠民和剂局方》，为黄芪与甘草6∶1相须配伍，擅补诸虚不足。基于此，本研究探索益气补虚的黄芪汤对胆管结扎致CPH大鼠门静脉压力的影响及其作用机制。

在肝硬化尤其CPH患者中，血清VEGF水平明显高于正常人，且与肝功能不全严重程度呈正相关，因此下调血清VEGF水平对降低CPH患者门静脉压力有重要意义。本实验结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠门静脉压力显著升高，血清VEGF水平显著升高，经黄芪汤干预后，大鼠门静脉压力、血清VEGF水平显著降低，且以黄芪汤高剂量组更明显。天狼猩红染色结果显示，与假手术组比较，模型组大鼠肝组织胶原沉积明显，假小叶大量形成，黄芪汤干预后，大鼠肝组织胶原沉积明显减少，其中黄芪汤高剂量组效果最为明显，提示黄芪汤能改善大鼠肝纤维化程度，降低门静脉压力，与降低血清VEGF水平密切相关。

肝窦毛细血管化是肝窦内皮细胞血管重构的一种表现，与门静脉高压的形成密切相关。VEGF是肝窦内皮细胞表型调节器，参与肝窦毛细血管化过程。在肝纤维化及门静脉高压的形成过程中，常伴有血管过度增生和VEGF水平升高，导致门静脉系统血流量增加，加速门体侧支循环形成，恶化高动力循环状态，最终使肝纤维化、门静脉高压与血管重构、过度增生之间呈现恶性循环。vWF和CD31是反映肝窦毛细血管化、肝窦内皮细胞表型变化的重要指标。本实验免疫组化结果显示，与模型组比较，黄芪汤各剂量组大鼠肝组织vWF和CD31表达明显降低，结合黄芪汤对门静脉压力的影响及肝窦毛细血管化与门静脉高压的相关性，说明黄芪汤降低门静脉压力与改善肝窦内皮细胞毛细血管化密切相关。

VEGF作为目前发现的特异性高、作用强的促血管内皮细胞生长因子，能促使血管内皮细胞增殖迁移，增强血管通透性，从而促进血管重构与新生。VEGF介导的PI3K/Akt/eNOS信号传导通路在CPH发生发展中占重要地位。eNOS是调控内源性一氧化氮产生的关键酶，VEGF能上调血管内皮细胞钙离子浓度，促进eNOS表达，介导一氧化氮生成，促进血管增生。Western blot 结果显示，模型组大鼠肝组织VEGF、eNOS蛋白表达及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值明显升高，黄芪汤各剂量组大鼠肝组织VEGF、eNOS蛋白表达及p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt比值明显降低，表明黄芪汤的作用与调控VEGF/PI3K/Akt/eNOS信号通路密切相关。

综上所述，黄芪汤可抑制VEGF/PI3K/Akt/eNOS信号通路相关蛋白表达，降低血清VEGF含量，抑制肝窦毛细血管化，进而发挥抗肝纤维化、肝硬化，降低门静脉高压的作用。