艾灸对菌群失调幼鼠结肠黏膜屏障的影响

姚雪含，刘喜平，朱中博

甘肃中医药大学，甘肃 兰州 730000

人体胃肠道通过多个生态系统的作用形成一个相对稳定的内环境，其中，稳定的肠道菌群及结肠黏膜对维持肠道内环境稳态有重要作用。一旦菌群受到破坏，有害菌过度增殖，进而影响结肠黏膜的保护作用，可引发功能性胃肠疾病或炎症性相关疾病。因此，平衡肠道菌群及预防结肠黏膜损伤，对构建幼儿菌群平衡及防治肠上皮屏障损伤相关胃肠道疾病具有重要意义。

艾灸是一种中医传统外治法，具有温经散寒、扶正祛邪、平衡阴阳作用。现代研究发现，艾灸可发挥温热作用，同时，艾烟及艾灰对机体神经系统、免疫系统等多系统发挥调节、治疗作用。通过刺激特定穴位，艾灸可发挥特定的靶向作用，还能通过下调促炎因子表达，对结肠黏膜起到抗炎修复作用。临床研究表明，艾灸能调节患者肠道菌群结构，修复损伤的肠道屏障。实验研究发现，艾灸预处理“天枢”对大鼠肠黏膜屏障具有保护作用。关元温肾以补虚、健脾而化湿，总领温阳化湿之意，标本兼治；神阙为周身神气通行之门户，具有振奋周身阳气、助阳化湿作用，同时促进经气运行，通利气机；中脘为脾胃气机升降之枢纽，可健运脾胃，使水谷运化有权，水津分布有法，从根源上杜绝水湿蓄积；天枢为机体升清降浊之枢纽，可助大肠泌别清浊、淡渗利湿，使水湿之邪有路可出，同时天枢为阳明经之募穴，阳明经为多气多血之经，可行气活血、健脾利湿。四穴共用，可益火生气、化湿和中，使气机流转顺达。因此，本实验通过观察艾灸“神阙”“中脘”“关元”“天枢”对菌群失调幼鼠结肠黏膜屏障的影响，从肠道菌群角度探讨艾灸保护结肠黏膜的机制。

1 实验材料

1.1 动物

3～4 周龄 SPF 级雄性 Balb/c 幼鼠 50 只，体质量10～15 g，北京维通利华实验动物技术有限公司提供，动物许可证号SCXK（京）2016-0006，饲养于甘肃中医药大学实验动物中心SPF级动物房，温度22～25 ℃，相对湿度45%～60%。本研究经甘肃中医药大学伦理委员会批准（2020-264）。

1.2 试剂

细艾条（直径7 mm，时时康艾灸堂），甲硝唑、硫酸新霉素、可溶性两性霉素B、脂多糖（北京索莱宝科技有限公司，批号分别为827L021、702I0512、511B059、408Z033），盐酸万古霉素（上海源叶生物科技有限公司，批号H13M11Y113102），氨苄西林胶囊（珠海联邦制药股份有限公司中山分公司，批号96003103），双歧杆菌四联活菌片（杭州远大生物制药有限公司，批号202005244），多聚甲醛溶液、PBS、中性树胶、伊红、苏木素（北京索莱宝科技有限公司，批号分别为 20191202、20200709、G8590、G1100、G1080），Occludin 抗体、ZO-1 抗体（英国 Abcam 公司，货号分别为ab216327、ab96587）。

1.3 仪器

PCR仪（美国Bio-Rad公司，型号T100），台式电热恒温鼓风干燥箱（余姚市星辰仪表厂，型号101-00），切片机（德国LEICA，型号2016），水浴锅（江苏荣华公司，型号SHA-C），显微镜（日本OLYMPUS，型号IX51），转膜仪（北京君意东方电泳设备有限公司，型号JY-ZY5），电泳仪（北京君意东方电泳设备有限公司，型号JY-SCZ2＋），高速冷冻离心机（美国BECKMAN，型号Microfuge 22R），超低温冰箱（中科美菱低温科技公司，型号DW-HL528），摇床（海门市麒麟医用仪器厂，型号TS-92），酶标仪（美国Thermo公司，型号Multiskan MK3），数码凝胶图像处理系统（美国Bio-Rad公司，型号ChemiDoc MP），恒温水浴锅（常州市江南仪器厂，型号HH-1）。

2 实验方法

2.1 溶液配制

参考文献[8]方法，将氨苄西林、盐酸万古霉素、甲硝唑、硫酸新霉素、两性霉素B用生理盐水溶解，得到浓度分别为10、5、10、10、0.1 mg/mL的混合抗生素溶液。双歧杆菌四联活菌片用生理盐水溶解，配制成浓度为68 mg/mL。

2.2 分组、造模及干预

50只幼鼠常规适应性饲养1周后，随机抽取10只作为空白组，其余幼鼠每12 h予混合抗生素溶液灌胃（氨苄西林100 mg/kg、盐酸万古霉素50 mg/kg、甲硝唑100 mg/kg、硫酸新霉素100 mg/kg、两性霉素B 1 mg/kg）复制抗生素暴露模型，灌胃体积10 mL/kg，连续灌胃14 d后，将幼鼠按随机数字表法分为模型组、阳性药组、艾灸组和联合组，每组10只。艾灸组固定于鼠板，将艾条固定在艾灸架上，垂直“神阙”“中脘”“关元”“天枢”上方点燃施灸，每穴4壮，15 min/次，施灸过程中使用表面测温仪测定体表温度，适时去除艾灰，调整施灸高度，确保体表温度在40 ℃左右；阳性药组予双歧杆菌四联活菌片溶液0.68 g/kg灌胃，灌胃体积10 mL/kg，同时固定相同时间；联合组艾灸同时予0.68 g/kg双歧杆菌四联活菌片溶液灌胃。1次/d，连续14 d。空白组只固定不干预，模型组予等量生理盐水灌胃，同时固定相同时间。

2.3 肠道菌群结构及多样性检测

末次干预12 h后收集幼鼠粪便（约200 mg），放于1.5 mL EP管中，置于-80 ℃冰箱保存，用于测序分析。采用Illumina NovaSeq测序平台，提取全基因组DNA，以稀释后的基因组DNA为模板，根据测序区域，使用带Barcode的特异引物和高效高保真酶进行PCR，PCR产物使用2%琼脂糖凝胶电泳检测，使用TruSeqDNA PCR-Free Sample Preparation Kit进行文库构建，经过Qubit和Q-PCR定量，NovaSeq6000进行上机测序。利用Uparse 算法（http://www.drive5.com/uparse/）对所有样品的全部有效数据进行聚类，默认以97%的一致性将序列聚类成为OTUs，筛选出现频数最高的序列作为OTUs的代表序列，作物种注释分析（设定阈值为0.8～1），并根据OTU分类对肠道菌群的α、β多样性及物种差异进行分析。本实验由苏州帕诺米克生物医药科技有限公司提供技术支持。

2.4 结肠组织病理形态观察

收集粪便6 h后，各组幼鼠均按10 mg/kg腹腔注射脂多糖（3 mg/mL）诱导肠道炎性反应。12 h后脱颈处死幼鼠，收集结肠组织，经4%多聚甲醛固定后，进行常规脱水、石蜡包埋、切片（厚度5 μm），二甲苯脱蜡5 min×2次，苏木素染色3 min，水洗1 min，伊红染色2 min，水洗30 s，梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。光学显微镜下观察结肠组织病理变化。

2.5 结肠组织Occludin、ZO-1蛋白表达检测

切取近端结肠组织约200 mg，剪碎后加入1 mL裂解液，冰上研磨30 min，4 ℃、12 000 r/min离心15 min，吸取上清液，BCA法测定蛋白浓度；加入5×loading buffer，水浴加热变性后，每孔15 μL上样，电泳，转膜，5%脱脂牛奶室温封闭1 h；滴加Occludin、ZO-1一抗（1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜5次，每次6 min；滴加二抗（1∶4 000），室温孵育90 min，TBST洗膜5次，每次6 min；TBS浸泡2 min，ECL发光液显影，数码凝胶图像处理系统成像，采用Image J 8.0软件测量条带灰度值，以GAPDH为内参，计算目的蛋白相对表达量。

3 统计学方法

4 结果

4.1 艾灸对模型幼鼠肠道菌群结构及多样性的影响

4.1.1 物种分布情况

在门分类水平上，空白组幼鼠肠道拟杆菌门与厚壁菌门丰度之和超过总微生物群落的90%；变形菌门丰度较低，为4%；疣菌门丰度不足1%。模型组幼鼠肠道微生物群落丰度发生变化，与空白组比较，模型组幼鼠肠道拟杆菌门、厚壁菌门丰度显著减少（＜0.01），变形菌门丰度显著增加（＜0.01），疣菌门差异无统计学意义（＞0.05）；与模型组比较，阳性药组、艾灸组和联合组幼鼠肠道拟杆菌门丰度显著增加（＜0.01），变形菌门丰度显著减少（＜0.01），艾灸组幼鼠肠道厚壁菌门、疣菌门丰度显著增加（＜0.01），阳性药组及联合组肠道厚壁菌门、疣菌门丰度差异无统计学意义（＞0.05）。见表1、图1。

表1 各组幼鼠肠道菌群门水平丰度比较（，%）

图1 门分类水平下各组幼鼠肠道菌群相对丰度比较

4.1.2 α多样性分析

α多样性可以反映样品内微生物群落的丰富度和多样性，常用物种累积箱形图和一系列分析指数表示。各组幼鼠的物种累积箱形图显示，物种数量随着样本量的增加趋于平缓，表明本实验样本量充足，足够反映样品的菌群数量。见图2。

图2 各组幼鼠肠道菌群物种累积箱形图

物种多样性指数包括Shannon、 Simpson，Shannon越高、Simpson越低，表示菌群多样性越高，物种分布越均匀。物种丰富度指数包括Chao1、ACE，Chao1、ACE越高，表示物种丰富度越高。与空白组比较，模型组幼鼠肠道菌群Shannon、Chao1、ACE均显著降低（＜0.01），Simpson显著升高（＜0.01）；与模型组比较，阳性药组、艾灸组和联合组幼鼠肠道菌群Shannon 显著升高（＜0.01），Simpson 显著降低（＜0.01），阳性药组幼鼠肠道菌群Chao1、ACE均显著降低（＜0.05）。见表2。

表2 各组幼鼠肠道菌群α多样性比较（）

4.1.3 β多样性分析

β多样性分析是对不同样品的微生物群落构成进行分析，其中主坐标分析（PCoA）是通过一系列特征值和特征向量排序，从多维数据中提取出最主要的元素和结构。PCoA结果显示，各组幼鼠肠道菌群密度不同、区域分散，模型组与空白组距离较远，3个干预组距离更接近空白组。方差分析＞1、＜0.05，提示组间差异有统计学意义。见图3。

图3 各组幼鼠肠道菌群PCoA

4.2 艾灸对模型幼鼠结肠黏膜病理形态的影响

空白组幼鼠结肠黏膜结构清晰，腺体完整，上皮细胞排列整齐。与空白组比较，模型组幼鼠结肠黏膜损伤严重，腺体消失，基层可见大量堆积的炎性细胞；与模型组比较，各干预组幼鼠结肠黏膜损伤减轻，腺体变长，可见少量炎性细胞浸润；与艾灸组、阳性药组比较，联合组幼鼠结肠黏膜损伤较轻，炎性细胞浸润较少。见图4。

图4 各组幼鼠结肠黏膜形态（HE染色，×200）

4.3 艾灸对模型幼鼠结肠组织Occludin、ZO-1 蛋白表达的影响

与空白组比较，模型组幼鼠结肠组织Occludin、ZO-1蛋白表达显著降低（＜0.01）；与模型组比较，阳性药组、艾灸组和联合组结肠组织Occludin、ZO-1蛋白表达显著升高（＜0.05，＜0.01）；与艾灸组及阳性药组比较，联合组幼鼠结肠组织Occludin、ZO-1蛋白表达显著升高（＜0.01）。见图5。

图5 各组幼鼠结肠组织Occludin、ZO-1蛋白表达比较（，每组3只）

5 讨论

近年来，抗生素普遍用于婴幼儿的临床治疗，但抗生素尤其广谱抗生素会损害肠道菌群结构及完整性，引起肠道菌群失调，导致肠内病原菌大量释放，损伤肠内壁，引起炎症，破坏结肠黏膜屏障，影响菌群定植并加重菌群紊乱。已有文献报道，艾灸能调节肠道菌群结构，抑制炎症因子释放，上调Occludin、ZO-1蛋白表达。为深入探讨艾灸对抗生素诱导的肠道菌群失调幼鼠结肠黏膜屏障的调节作用，本实验开展了相关研究。

正常肠道微生物群主要由厚壁菌门和拟杆菌门组成，属优势菌门，对维持肠内稳态至关重要。变形杆菌是变形菌门的代表菌，是肠道的低丰度共生菌，属条件致病菌。疣菌门在肠道中丰度不高，只包含Akkermansia muciniphila（AKK菌）1个成员，其与宿主代谢和免疫治疗的全身效应具有很强相关性，能诱导小鼠免疫球蛋白G1抗体和抗原特异性T细胞反应，促进黏膜愈合，属于功能性益生菌。肠道微生物群落结构分析表明，空白组幼鼠肠道优势菌群为拟杆菌门和厚壁菌门，变形菌门、疣菌门丰度较低，与文献[15]一致。模型组幼鼠肠道变形菌门丰度增加，拟杆菌门和厚壁菌门丰度减少，疣菌门丰度无明显变化。经不同方法干预后，变形菌门丰度均显著减少，拟杆菌门和厚壁菌门丰度增加，虽然与空白组有一定差异，但菌群结构趋于正常。在肠道菌群α多样性方面，模型组幼鼠肠道Chao1、ACE、Shannon降低，Simpson升高，说明肠道菌群组成和结构发生改变，肠道菌群平衡被打破。阳性药组、艾灸组和联合组幼鼠肠道Shannon升高、Simpson降低，提示肠道菌群多样性升高，平衡逐渐恢复。

脂多糖是先天免疫系统有效的激动剂，能诱导强烈的促炎反应，刺激宿主细胞分泌促炎因子。经脂多糖诱导后，模型组幼鼠结肠黏膜损伤程度较严重，说明菌群紊乱影响结肠黏膜完整性，使其抵御炎性损伤的能力下降；与模型组比较，各干预组幼鼠结肠黏膜损伤有不同程度减轻，提示相对稳定的肠道菌群能在一定程度上抵御炎性损伤，保护结肠黏膜。与艾灸组、阳性药组比较，联合组幼鼠结肠黏膜损伤最轻，结构较为完整，无明显炎性细胞浸润，提示艾灸与阳性药联合使用能发挥协同保护作用。研究表明，艾灸可增加溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜紧密连接蛋白Occludin和ZO-1 表达，恢复结肠黏膜屏障功能，保护肠黏膜。另有报道，菌群丰度增加亦能提高相关蛋白表达。本实验中模型组幼鼠结肠组织Occludin和ZO-1蛋白表达降低，不同方法干预后，Occludin和ZO-1蛋白表达均升高，提示其保护结肠黏膜的机制与紧密连接蛋白具有相关性。

综上所述，艾灸“神阙”“中脘”“关元”“天枢”对抗生素诱导的菌群失调幼鼠结肠黏膜屏障有良好的保护作用，其机制可能与增加肠道菌群多样性、恢复紊乱的肠道菌群水平及保护结肠黏膜屏障有关。本实验可为临床预防幼儿菌群紊乱及肠道炎症疾病提供思路，为临床合理应用抗生素及防治结肠黏膜屏障损伤相关胃肠道疾病提供实验依据。