一种西葫芦根腐病病原鉴定及其致病范围

耿丽华，史 越，张国裕，李海真，宋顺华

（农业农村部华北地区园艺作物生物学与种质创制重点实验室·农业农村部都市农业（北方）重点实验室·北京市农林科学院蔬菜研究所 北京 100097）

西葫芦（L.）是我国重要的经济作物之一，在北京的生产以果实作为蔬菜为主，其含有较多的维生素C，具有较高的栽培价值，深受广大消费者的喜爱。近年来，由于长期的连作使得土传病害日益蔓延，因此在栽培过程中容易受到病害的危害，并造成极大的损失。西葫芦根腐病一直是保护地种植中西葫芦的重要病害，主要造成植株萎蔫和烂根，国内外均有研究报道。该病发病率高，往往导致发病植株死亡，严重影响产量。迄今为止，国内外已报道可引起西葫芦萎蔫和根腐的病原菌很多，而且差异很大，主要的病原菌有疫霉菌、露湿拟漆斑菌和腐皮镰刀菌，均为常见的土壤习居菌，但导致北京地区西葫芦根腐病的病原菌种类尚未见报道。

2020 年5 月，京郊四季青试验基地温室栽培的西葫芦出现了一种新的根部病害，该病害在初花期开始发生，当发现有植株萎蔫时，病株率已经达到30%以上。仔细观察萎蔫植株，其根部腐朽，用手轻轻向上拉动植株地上部分，植株可以从茎基部断开，切开其茎基部可见维管束褐化。为弄清京郊发生的西葫芦根腐病病原，笔者采集典型发病植株，对病原菌进行分离鉴定，并进一步对该病原菌的致病范围进行了测定,以期为该病的有效防治提供依据。

1 材料和方法

1.1 材料

供试发病植株：具有典型发病症状的西葫芦植株于2020 年5 月在京郊四季青试验农场的温室内采集。

供试品种：试验所用的西葫芦、西瓜、甜瓜、南瓜、黄瓜、番茄、辣椒、茄子、白菜、油菜、甘蓝、萝卜等26 个品种（表1），均从京研益农（北京）种业科技有限公司购买。

表1 供试蔬菜品种

试剂及仪器：真菌基因组DNA 快速抽提试剂盒，北京新时代众合科技有限公司；其他无机试剂均为国产分析纯试剂。

培养基：马铃薯葡萄糖琼脂培养基（potato dextrose agar，PDA）：马铃薯200 g、琼脂17 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1000 mL；康乃馨水琼脂培养基（carnation leaf agar，CLA）：琼脂20 g、蒸馏水1000 mL、每个6 cm 直径的培养基平板上加入大小约为4 mm的康乃馨叶片4～5 块。马铃薯葡萄糖液体培养基（potato dextrose，PD）：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1000 mL。所有培养基使用之前均于120 ℃高压灭菌20 min。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离纯化 采用常规组织分离法，从典型发病植株根茎的病健交界处取小块组织，在75%乙醇溶液中浸泡2 s，用灭菌水冲洗3次，用灭菌滤纸吸干水分，放置在PDA 平板上25 ℃恒温培养至菌丝长出，分离菌株并单孢纯化。

1.2.2 分离物致病性测定 将分离物在25 ℃条件下PDA 培养7 d，从菌落边缘取直径为5 mm 左右的菌丝块5 个，加入装有250 mL PD 液体培养基的平底瓶（500 mL）中，120 r·min、25 ℃振荡培养7 d后过滤，将过滤液离心收集孢子，加无菌水配制成浓度为1×10个·mL的孢子悬浮液，备用。将灭菌的栽培土（∶∶＝4∶2∶1）按10∶1 的比例与孢子悬液混合均匀，装入口径210 mm 营养钵供播种用。将供试种子分别于2%NaCl 溶液浸泡5 min，捞出控干水分，催芽后播种；每钵播10 粒出芽种子，每个品种播种2 钵（接菌和不接菌对照各1钵），置于25～30 ℃温室中常规管理。3 次重复，随机区组设置。

播种后，观察植株的发病情况，同时对发病植株进行症状观察、病原菌分离及病原菌形态观察和比较。

1.2.3 病原菌的鉴定 形态学鉴定：在25 ℃黑暗条件下，PDA 培养病原菌，观察菌落形态并测量其7 d 的平均生长速率；在25 ℃黑暗条件下，CLA 培养病原菌，显微观察大型分生孢子、小型分生孢子，在倒置显微镜下直接观察小型分生孢子的产生方式。依据Leslie 和Summerell 等相关分类方法进行种类鉴定。

分子生物学鉴定：在25 ℃条件下，PDA 培养病原菌5 d，收集菌丝体，加液氮研磨成粉末，用试剂盒提取其DNA；采用真菌通用引物ITS1/ITS4进行该病原菌rDNA 核糖体内转录间隔区的PCR 扩增，并进一步采用翻译延伸因子-引物EF-1/EF-2进行-序列的PCR 扩增。反应体系及扩增参照耿丽华等的方法进行。扩增片段由北京新时代众合科技有限公司进行测序，将得到的序列在NCBI 中检索并下载同源序列，然后使用MEGA 7 软件，用邻接法构建系统发育树，并用自举法对发育树进行1000 次重复检验。

1.2.4 病原菌致病范围测定 每个品种挑选10 粒经过催芽的种子用于播种。病原菌接种方法、播种和管理方法同1.2.2。试验均设不接种作为对照。播种后，观察记录植株的发病和死亡情况。以地上部出现萎蔫、植株死亡或茎基部出现褐化为发病标准，发病率为发病株数占供试株数的百分比。

2 结果与分析

2.1 分离物及其致病性测定

取西葫芦发病植株茎基部的病健交接处进行分离培养，获得2 个分离物。经过致病性测定，其中1 个分离物能够使西葫芦发病，可观察到接种发病的西葫芦幼苗的茎基部褐化，同时，所设未接种的对照生长正常、没有任何症状（图1）。对接种发病植株进行分离培养，再次获得的分离物与所接种的分离物形态一致，证明该分离物为病原菌。另一个分离物不能使西葫芦发病，不是该病害的病原菌。

图1 致病性测定

2.2 病原菌鉴定

2.2.1 形态鉴定 由图2 可以看出，病原菌在PDA培养基上菌落为圆形，边缘整齐，菌丝呈灰色绒毛状，从菌落背面可以观察到棕色色素；25 ℃条件下PDA 培养7 d，其生长速率为9.8 mm·d左右。

图2 菌落形态

由图3 可以看出，病原菌在CLA 培养基上，大型分生孢子稍弯曲，3～7 个隔，以4～5 个隔为多；小型分生孢子椭圆形、肾形或卵形，0～1 个隔，多数无隔；小型分生孢子最初聚生在长单瓶梗上的圆形假头内，随着小型分生孢子的成长，假头的包膜逐渐变薄，最后包膜彻底溶解，小型分生孢子分散出来。

图3 病原菌分生孢子显微形态特征

上述形态特征与腐皮镰刀菌相符。

2.2.2 分子生物学鉴定 提取该病原菌的DNA，对rDNA-ITS 和-序列进行PCR 扩增，获得片段大小分别为587 bp 和726 bp。将这2 个序列分别提交至NCBI 进行同源序列检索，结果均与腐皮镰刀菌的序列同源性最高，达到99%。

基于该病原菌的-序列与NCBI 中属的相关序列构建系统发育树（图4），该病原菌（Xh-EF）与KF372878 腐皮镰刀菌菌株聚在同一分支，表明该病原菌为腐皮镰刀菌。

图4 基于TEF-1α 基因序列构建的系统发育树

2.3 病原菌致病范围测定

由表2 可以看出，在接种后第21 天时，供试的4 个西葫芦品种发病程度有较大差异，京葫1 号、京珠、京碧和京葫2 号植株发病率分别为70.00%、20.00%、10.00%和0。发病率随着时间的延长而增加，接种后第35 天时，4 个品种的发病率均达到100.00%。南瓜和黄瓜在接种后第28 天时开始出现发病症状，发病率在品种间存在较大的差异，到接种后第42 天，黄瓜京研绿玲珑2 号和京研优胜的发病率分别为100.00%和60.00%；接种后第49天时，南瓜京欣砧6 号和京欣砧4 号的发病率分别为100.00%和10.00%。供试西瓜和甜瓜品种发病较晚，分别在接种后第42 天和第49 天才开始出现发病症状，西瓜华欣和京颖的植株发病率均为60.00%，2 个品种的发病率没有差异；甜瓜京玉30和京玉绿宝的植株发病率分别为20.00%和25.00%，品种间发病率差别较小。供试的十字花科和茄科蔬菜的所有品种到接种后第49 天时都没有出现发病症状，植株发病率均为0。

表2 人工接种后不同蔬菜品种的植株病死率 %

3 讨论与结论

针对京郊发生的西葫芦根腐病，笔者通过病原菌分离，并对其进行形态学和分子生物学鉴定，结果表明病原菌为腐皮镰刀菌，这与我国已报道的西葫芦根腐病病原菌不同，而与西班牙Ana 等报道的结果相同。

已有的研究表明，腐皮镰刀菌的寄主范围非常广泛。据国内报道，它可导致甜瓜、西瓜、番茄和辣椒的根腐病，国外也有该菌为害西瓜、黄瓜、甜瓜和南瓜，引起根腐病的研究报道，但腐皮镰刀菌导致西葫芦根腐病在我国尚属初次报道。致病范围研究结果表明，引起西葫芦根腐病的腐皮镰刀菌能导致葫芦科蔬菜的所有供试品种发病，但是不能导致茄科蔬菜和十字花科蔬菜的所有供试品种发病，这与Ana 等报道的研究结果一致。

本研究结果还表明，该病原菌在葫芦科的不同品种之间表现出致病性的差异。其中西葫芦发病最早，病情发展迅速，而其他葫芦科蔬菜均比西葫芦发病晚，发病率也较低。同一种类的不同品种也存在感病性的差异，在接种后21 d 时，4 个西葫芦品种的植株发病率为0～70.00%，2 个南瓜品种在接种后49 d 时，发病率分别为10.00%和100.00%，因此，不同品种间的感病性有非常明显的差别。本研究的致病范围测定是在病原菌孢子接种压力极大的条件下进行的，进一步研究可通过适当降低接种压力对葫芦科蔬菜进行品种抗病性鉴定，从而筛选出相对抗病的品种或种质资源。

腐皮镰刀菌根腐病是土传病害，在发病初期不容易被生产者发现，一旦出现植株萎蔫症状，杀菌剂的防治效果不理想。笔者通过病原菌分离鉴定、较为系统的病原菌致病范围测定，对于有针对性地防治该病害具有指导性的意义。依据本文的研究结果，为了有效防控腐皮镰刀菌根腐病，在生产上可以采用不同种类瓜菜进行轮作，在茬口安排上西葫芦不可与黄瓜、西瓜、甜瓜、南瓜等葫芦科作物轮作，可以与茄科作物、十字花科作物轮作，以减轻腐皮镰刀菌根腐病的危害。