铜诱导调节性细胞死亡的作用机制与抗肿瘤治疗的研究进展

朱洁洁，王华，2

(1. 安徽医科大学第一附属医院肿瘤科，安徽 合肥 230031； 2. 安徽医科大学炎症免疫性疾病安徽省实验室，安徽 合肥 230032)

铜是一种生物必需的过渡金属元素，可作为多种酶的辅因子参与各种酶促反应和重要的生物学过程，维持机体正常的生长发育和细胞代谢等。铜含量过载或缺乏可导致细胞功能受损，最终导致细胞死亡[1]。一般来说，细胞可能死于意外细胞死亡(accidental cell death, ACD)或调节性细胞死亡(regulated cell death, RCD)。 ACD是生物学上不可控的过程，而RCD涉及复杂的级联信号通路和分子效应机制。生理情况下发生的RCD通常称为程序性细胞死亡(programmed cell death， PCD)，而细胞凋亡是PCD中研究最广泛的一种形式，是可调控的、由基因控制的细胞自主和有序的死亡，其形态特征包括细胞皱缩、染色质凝集、核碎裂和DNA片段化等[2]。 目前发现的RCD类型已经超过10种，除了常见的细胞凋亡，还包括多种非凋亡型RCD，如自噬、铁死亡、焦亡和内源性细胞死亡等[3-4]。Tsvetkov等[5]于2022年3月份在顶级学术期刊Science上提出一种新的不同于已知的RCD方式，并命名为“铜死亡(cuprotosis)”，是一种依赖于铜的、可受调控的新型死亡方式，并且与线粒体呼吸紧密相关。

近来研究发现，铜离子含量超载或缺乏可导致各种疾病，如与年龄相关的神经退行性疾病如阿尔茨海默病[6]、铜代谢障碍的遗传性疾病如肝豆状核变性[7]和慢性肝肾疾病如肾纤维化等[8]。研究表明，肿瘤患者血清和实体肿瘤组织中的铜离子含量显著高于健康者[9-10]，其含量增加可促进肿瘤细胞的增殖与转移、促进血管生成等[11]。铜配合物是由铜离子与某些配体以配位键结合形成的配位化合物，其可与DNA和蛋白质作用，诱导氧自由基产生，并破坏磷酸二酯键，进而促进DNA水解[12]。因此，本文针对铜诱导调节性细胞死亡的作用机制及铜配合物在肿瘤治疗中的研究进展作一简要综述。

1 铜的吸收和分布

铜主要通过食物获取，经肠道细胞吸收，成年人每日膳食中铜摄入量为0.9 mg[13]。铜在机体内以亚铜离子(Cu+)和铜离子(Cu2+)两种形式存在。目前认为，细胞外铜离子以Cu2+的形式存在，与二价金属转运体1(divalent metal transporter 1，DMT1)结合后经还原酶还原为Cu+，进而与跨膜铜转运体1(copper transporter 1, CTR1)结合后进入细胞[14]。然后，Cu+通过胞质、线粒体和高尔基体3种途径靶向至不同的铜蛋白[15]。最后，这些与铜离子组装的铜蛋白经分类至特定的细胞器或依赖于铜伴侣蛋白抗氧化物1(Atox1)/ATP酶途径分泌至循环血液中[16-17]。

2 铜诱导调节性细胞死亡的作用机制

体内铜离子含量维持动态平衡，当平衡失调时，可产生细胞毒性，并通过多种途径诱导细胞死亡。另外，若机体暴露于大量的铜外源物，吸收过量的Cu2+，则使体内羟基自由基产生增加，细胞内活性氧水平升高，致脂质过氧化增强，进而导致氧化应激和细胞凋亡[18-19]。此外，CTR1过表达和细胞内谷胱甘肽(glutathione, GSH)的耗竭均可增强铜离子诱导的细胞死亡，突触核蛋白过表达也可通过调节蛋白质降解途径加剧多巴胺能细胞中的铜离子毒性[20]。

2.1 氧化应激诱导细胞凋亡

体内细胞维持氧化和抗氧化动态平衡，当平衡紊乱时即可产生氧化应激，导致相关细胞损伤从而诱发肿瘤形成[21]。芬顿(Fenton)反应是最重要的金属介导型反应之一，如反应a与b所示，铜离子在氧化和还原状态之间循环，并形成羟基自由基[22]。羟基自由基可与DNA和脂质反应，分别引起DNA损伤和脂质过氧化[23]。

由于肿瘤细胞的高增殖率和高能量需求，其处于比正常生理细胞更高的活性氧应激状态，更易介导细胞凋亡[24-25]。铜离子载体与铜结合时产生活性氧，可诱导氧化应激，损伤DNA，导致细胞周期阻滞[26]。Shimada等[27]研究表明，NSC319726除可作为Zn2+载体，还可作为Cu2+载体在多种癌细胞模型中起作用，其结合并激活Cu2+，促进Cu2+与Cu+之间的氧化还原反应，致脱氧核糖核苷酸耗竭，无法合成DNA，使细胞周期停滞于G1期，进而触发细胞凋亡。Yip等[28]研究发现，双硫仑对体外培养的乳腺癌细胞有较强的铜依赖性毒性，双硫仑和Cu2+结合应用可抑制乳腺癌细胞集落形成，并显著增强紫杉醇的细胞毒性；其具体机制为双硫仑-Cu2+复合物诱导产生活性氧，进而激活其下游与细胞凋亡相关的JNK和p38 MAPK通路，同时抑制NF-κB信号途径，从而诱导乳腺癌细胞凋亡。由此说明，铜离子与抗癌药物结合产生活性氧，形成氧化应激，抑制抗凋亡因子，激活凋亡相关通路，从而诱导癌细胞凋亡。另外，铜衍生的铜配合物也可促进癌细胞凋亡。Cen等[29]研究发现，Cu2+与双硫仑通过复杂的胞外氧化还原反应形成配合物二乙基二硫代氨基甲酸铜[Cu(deDTC)2]，该铜配合物抗黑色素瘤活性较高，导致黑色素瘤细胞株凋亡率明显增加。这种氧化还原反应为Cu2+所特有，其他金属如铁、锰等离子则无。

2.2 抑制泛素—蛋白酶体系统

泛素—蛋白酶体介导的蛋白酶解系统调节多种蛋白的表达水平和活性，参与调节细胞周期、增殖和凋亡等细胞过程[30]。该蛋白酶解系统中蛋白降解包括泛素化和降解两条不同途径。泛素化是指通过泛素标记靶蛋白，使蛋白酶体复合体选择性地识别靶蛋白进而将其降解。目前，蛋白酶抑制剂如硼替佐米已广泛应用于多发性骨髓瘤等疾病的治疗，表现出强抗肿瘤活性[31]。Chen等[32]研究发现，双硫仑-Cu2+配合物在诱导乳腺癌细胞凋亡开始之前，乳腺癌细胞内蛋白酶体活性持续受到抑制，致使泛素化蛋白增加，而且该过程在正常的乳腺细胞中尚未发现；除此之外，双硫仑和Cu2+分别单独作用时对乳腺癌细胞的蛋白酶体活性抑制作用很小，说明抑制蛋白酶体系统的是Cu2+，双硫仑将Cu2+携带至乳腺癌细胞中并阻止其与其他非特异性蛋白质相互作用。Skrott等[33]研究发现，双硫仑-Cu2+配合物可阻断蛋白酶解系统上游的信号传导，损害泛素化依赖性的ATP合酶，即含缬酪肽蛋白的功能，进而抑制泛素化蛋白的降解。由此表明，Cu2+配合物可成为有效的蛋白酶体抑制剂，抑制某些肿瘤细胞的蛋白酶体活性，进而抑制细胞增殖。

2.3 诱导铜依赖性细胞死亡

Tsvetkov等[34]在2019年研究发现，线粒体能量代谢改变时，氧化磷酸化过程致肿瘤细胞对蛋白酶体抑制剂耐药性增强，但对新型小分子药物伊利司莫(elesclomol)的敏感性也增强。伊利司莫是一种铜离子载体，目前为抗癌药物，其可与Cu2+络合形成配合物。伊利司莫-Cu2+配合物进入细胞内，Cu2+经铁氧化还原蛋白1(ferredoxin 1, FDX1)还原成Cu+，进一步导致细胞死亡，其具体作用机制尚不明确。Caspase-3和Caspase-7是细胞凋亡通路的下游效应因子，但抑制二者活性后，伊利司莫介导的细胞死亡不受影响。铁死亡是一种铁依赖性的非凋亡形式调节细胞死亡的过程[35]，但铁死亡抑制剂不能挽救伊利司莫诱导的细胞死亡。由此说明，伊利司莫参与促进一种独特的铜依赖性细胞死亡，且不能被细胞凋亡抑制剂或铁死亡拮抗剂所阻断。

2022年3月，Tsvetkov等[5]研究首次指出，铜诱导的细胞死亡由蛋白质脂酰化所介导，且与线粒体活性相关，并首次将这种铜依赖的新型死亡方式命名为“铜死亡(cuprotosis)”。铜死亡所涉及的蛋白质脂酰化过程是一种罕见且高度保守的赖氨酸翻译后修饰，目前哺乳动物中只发现4种脂酰化蛋白质组成的酶复合体，包括丙酮酸脱氢酶(pyruvate dehydrogenase, PDH)、α-酮戊二酸脱氢酶(alpha-ketoglutarate dehydrogenase, KDH)、支链α-酮酸脱氢酶(branched-chain alpha-keto acid dehydrogenase, BCKDH)和甘氨酸裂解体系(glycine cleavage system, GCV)[36]。PDH和KDH直接参与三羧酸循环，BCKDH则负责支链氨基酸分解代谢中的脱羧基过程，而GCV在甘氨酸的分解代谢中发挥重要作用[36-37]。这些酶对维持线粒体正常代谢至关重要，其直接或间接参与线粒体三羧酸循环，与铜离子结合后导致脂酰化的蛋白质聚集，致线粒体代谢功能紊乱，进而诱导细胞死亡。敲除脂酰化蛋白的关键上游调节因子FDX1或脂酰化相关酶则可以阻断铜死亡。Tsvetkov等[5]研究同时发现，铜毒性与线粒体活性之间关系密切，这可能与线粒体代谢旺盛、三羧酸周期活跃的细胞的脂酰化蛋白水平较高有关。该机制解释了与遗传性铜超载障碍相关的发病原因，也提供了肿瘤治疗的新视角。

3 铜配合物在肿瘤治疗中的应用

研究表明，铜离子参与上皮—间充质转化、丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinase, MAPK)等信号通路激活，还可调节自噬过程、促进肿瘤周围的血管生成等，进而影响肿瘤细胞的增殖和转移[38-40]。目前认为铜是抗肿瘤药物的候选金属材料。由于铜的生理特性及其活跃的氧化还原反应能力，Cu+和Cu2+可与多种配体结合，其中，Cu+可与双膦配体、氮配体、多吡啶等结合，Cu2+可与席夫碱、双硫仑、对氯苯甲酸等配体结合，从而产生多种不同的铜配合物。随着纳米技术的发展，尺寸较小、生物相容性好、可以靶向至肿瘤中的铜纳米材料也开始应用于肿瘤治疗中。

3.1 化学动力学疗法

近来，化学动力学疗法(chemodynamic therapy，CDT)作为一种新兴的治疗方式受到了广泛关注。CDT指肿瘤组织中产生的H2O2通过金属离子介导的芬顿或芬顿类反应转化为具有强氧化性的羟基自由基，进而杀死肿瘤细胞[41]。与化疗不同，CDT无须引入抗癌药物和外界刺激，不良反应小、操作简单，是肿瘤治疗的一个新兴方向。研究报道，几种含铜配合物在肿瘤治疗中具有潜在的应用价值。Kordestani等[42]研究指出，采用硝酸铜、乙二胺、3，5-二溴水杨醛和三乙胺等原料合成的Cu2+配合物——3，5-二溴水杨醛亚胺合硝酸铜，可抑制人A2780卵巢癌细胞增殖；与卵巢癌化疗敏感药物顺铂相比，其半数抑制浓度较低。为更好地提高药物对肿瘤细胞的特异性，Luo等[43]制备了一种简单可行的生物素化的含Cu+配合物——生物素氯化亚铜复合物(Bio-CuCl)，其中的生物素部分可以靶向生物素受体阳性的肿瘤细胞，特异性地杀伤肿瘤细胞。但是，纳米颗粒的穿透能力差和肿瘤细胞具有的抗氧化活性降低了CDT的疗效。基于此，Zheng等[44]将铜纳米颗粒用锌原卟啉IX负载，用聚乙二醇化的氧化钼铜(CuMoOx)包裹，通过抑制血红素氧合酶-1的活性，结合GSH并阻断其抗氧化作用，为CDT提供了良好的易氧化的微环境，增强了杀伤肿瘤细胞的效果。

单一的治疗方式往往导致肿瘤细胞耐药的发生，协同治疗可提高疗效。Chen等[45]研究发现，协同饥饿—CDT治疗可有效地抑制肿瘤生长；其通过层层组装，将CuS纳米颗粒包裹在多聚赖氨酸—葡萄糖氧化酶—透明质酸壳中，构建出一种花生状纳米药物，其中，透明质酸壳层对CD44的电荷转化和特异性识别不仅为铜纳米药物提供了较长的循环时间和特异性的肿瘤靶向能力，而且使其在肿瘤部位有较长的作用停留时间；葡萄糖氧化酶暴露后，消耗内源性葡萄糖进行饥饿治疗，然后通过Cu2+介导的芬顿类反应转化为剧毒的羟基自由基进行CDT。此外，该纳米颗粒还可招募不同的免疫细胞进行抗肿瘤免疫治疗。Cu2+和DNA酶二者组合成混合纳米材料，通过协调相互作用共同转运至肿瘤细胞中，释放的Cu2+经GSH还原为Cu+，用于CDT；DNA酶可用来切割RNA，它可高效切割血管内皮生长因子-2(VEGF2)mRNA，致VEGF2基因表达下调从而实现基因治疗。由Cu2+和DNA酶配位组合形成的配合物诱导联合抗肿瘤效应，有效抑制体内肿瘤的生长[46]。

3.2 光疗

肿瘤局部光疗法是一种新兴的可有效抑制肿瘤生长的方式，主要包括光动力疗法和光热疗法，依靠光疗剂(包括光敏剂和光热试剂)将光能转化为化学能或热能，从而杀死肿瘤细胞[47]。光疗中的光照度可从空间控制，只照射目标部位，选择性地作用于肿瘤细胞。光热动力疗法采用的是可穿透组织的光敏剂，将其注射至人体，由于肿瘤组织的高吸收、低代谢的特点，光敏剂可以特异性地滞留在肿瘤组织内，然后经特定波长的激光激活，催化一系列化学反应产生活性氧，从而诱导肿瘤细胞死亡[48]。该疗法对光敏剂性能要求较高，需组织渗透性高、光毒性强。Wang等[49]研究发现，羧基与铜离子配合形成的新型铜配合物碳点铜(copper-doped carbon dots, Cu-CDs)，可产生良好的光诱导细胞毒性，有效地抑制人宫颈癌细胞和神经母细胞瘤细胞生长。由此表明，碳点铜可能是一种有前景的光敏试剂。Shrestha等[50]研究发现，铜半胱胺纳米粒子作为新型的光敏剂，经X射线辐射激活后可使小鼠皮下种植的右侧乳腺癌肿瘤组织体积显著减小，其可能是进行深部肿瘤光热动力疗法的良好候选者。

除了光热动力疗法，光热疗法也很常见，其通过利用具有近红外吸收的光热材料在激光照射下实现局部高温，从而有效地杀灭肿瘤细胞。Weng等[51]通过在氩气下经不同的温度制备出一种新型的光热剂——负载在碳多面体中的铜纳米颗粒；静脉注射该纳米颗粒后行808 nm波长光照，3 min内小鼠皮下种植宫颈癌肿瘤部位温度急剧上升，10 min后肿瘤部位最终温度为64.6 ℃，从而达到有效的热疗效果，并且20 d后小鼠肿瘤组织完全消退；与之相反，静脉注射PBS的小鼠肿瘤组织在连续光照下没有明显的温度变化，20 d后肿瘤体积明显增大。由此说明，该纳米材料具有较好的近红外光吸收特性，光热转换效率高，其制成的光热剂有潜在的应用前景，可用于抗肿瘤治疗。Hou等[52]研究发现，转铁蛋白修饰的介孔空心硫化铜纳米颗粒材料在荷瘤小鼠的乳腺癌肿瘤部位处的局部蓄积和滞留时间长，具有较强的近红外吸收和光热转换效率，可有效地将近红外光转化为热能用于光热治疗，同时还可以产生高水平的活性氧用于光动力治疗。

3.3 化疗

研究表明，铜配合物与化疗药物联合使用可增强化疗药物的敏感性，具有良好的协同作用。Bortolozzi等[53]研究发现，在两种急性淋巴细胞白血病的细胞系(RS4;11和SEM细胞系)中，由Cu2+配位而成的配合物——六氟磷酸三羟甲基膦铜，与常见化疗药物地塞米松、柔红霉素、阿糖胞苷和长春新碱分别联合治疗，以协同方式增强了药物单独作用时的抗急性淋巴白血病细胞增殖作用，尤其是与阿糖胞苷协同作用较强。铜配合物可通过影响铜稳态调节过程在铂类药物的治疗中发挥重要作用[54]。D-青霉胺可与Cu2+形成配合物，致体内Cu2+含量降低，CTR1蛋白表达上调，从而增强奥沙利铂对人结肠癌细胞株的细胞毒作用[55]。同样，研究发现，在宫颈癌模型小鼠(HPV16/E2)中，铜螯合物四硫代钼酸盐联合顺铂治疗的小鼠体内CTR1 mRNA表达水平增高，顺铂对小鼠宫颈癌细胞的摄取和杀伤力增强，抗肿瘤效果增强[56]。铜转运ATP酶α(ATP7A)和铜转运ATP酶β(ATP7B)为铜转运体，介导铜离子的转运和排泄，研究发现，二者高表达与卵巢癌、非小细胞肺癌、结直肠癌等肿瘤患者的预后差和对铂类药物的耐药性有关[57]。由此推测，铜和铂类药物可能共享同一摄取、转运系统，而铜配合物可通过降低铜离子含量，改变铜转运体活性，增强铂类摄取，进而增强铂类的抗肿瘤效果。但是，具体何种类型肿瘤适合于以铜为靶点或利用铜的治疗仍有待深入研究。

3.4 免疫治疗

肿瘤免疫疗法是一种刺激免疫系统重启，使机体恢复并维持抗肿瘤免疫反应的方法。抗程序性死亡蛋白1(programmed death protein 1, PD-1)和程序性死亡受体—配体1(programmed death-ligand 1, PD-L1)是两个重要的免疫检查点蛋白。肿瘤细胞表达的PD-L1与T淋巴细胞表面的受体PD-1结合，可以抑制细胞毒性T细胞对肿瘤细胞的杀伤作用，从而引起免疫抑制[58]。近来研究发现，铜可以调节PD-L1表达。Voli等[59]研究发现，在神经母细胞瘤细胞中由于CTR1表达增加，导致Cu2+含量增加，并激活表皮生长因子受体信号通路，导致PD-L1 mRNA和蛋白表达水平增加；当给予神经母细胞移植瘤模型小鼠服用铜络合剂四乙烯五胺五盐酸盐时，Cu2+含量降低，神经母细胞瘤细胞中PD-L1表达降低，导致肿瘤浸润性T细胞数增加，肿瘤生长减缓，小鼠存活率提高。由此表明，通过药物降低肿瘤内铜离子含量可增强抗肿瘤免疫治疗。

4 结语

铜作为机体必需的一种微量金属，在细胞代谢中起重要作用。体内铜离子含量保持动态平衡，过量或缺乏可导致多种疾病。铜可通过多种方式诱导调节性细胞死亡，如诱导氧化应激、抑制蛋白酶体等，以及最新发现并命名的“铜死亡”，促进以铜为靶点的抗肿瘤治疗。目前针对铜稳态治疗的抗肿瘤作用机制主要有两种，一种是铜络合剂，结合铜离子并降低其含量，抑制肿瘤细胞的增殖和转移；另一种是铜离子载体，将铜离子输送至细胞内，以增加细胞内Cu2+水平，产生活性氧等，诱导肿瘤细胞死亡[54，60]。铜配合物也可与传统的化疗、放疗等协同作用，增强抗肿瘤疗效。