咽拭子、肺泡灌洗液肺炎支原体-DNA水平与社区获得性肺炎支原体肺炎炎性反应及免疫功能的关系

田增春，梁璐，刘阳，曾苑，薛海蓉

作者单位：南阳市中心医院儿一科，河南 南阳 473000

社区获得性肺炎支原体肺炎（community acquired-mycoplasma pneumoniae pneumonia，CA-MPP）为儿童多发性肺炎类型，主要由肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）侵袭病儿下呼吸道所致［1-2］。临床研究指出，CA-MPP 的病情受MP 致病性、耐药性及病儿免疫功能等因素影响［3］。此外，MP 可通过自身及代谢产生的毒性物质损伤人体组织，并引发一系列炎症反应、免疫反应加重症状损伤［4］。但CA-MPP 病儿MP-DNA 与炎性、免疫反应的关系仍缺乏循证依据。本研究尝试分析咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 水平与CA-MPP 病儿炎性反应、免疫功能的关系，旨在为临床治疗本病提供参考依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2018 年1 月至2019 年5 月南阳市中心医院收治的CA-MPP 病儿92 例，其中女29例，男63 例；年龄范围为6 个月至12 岁，年龄（3.15±1.32）岁；重症病儿30例，轻症病儿62例。本研究符合《世界医学协会赫尔辛基宣言》相关要求。

纳入标准：（1）符合MPP 诊断标准［5］，且为急性期；（2）双份血清抗体滴度升高4 倍及4 倍以上；（3）均为社区获得性；（4）首发症状均为发热、咳嗽；（5）年龄≤12 岁；（6）无混合其他感染；（7）均需行支气管肺泡灌洗；（8）病儿近亲属知晓本研究，已签署同意书。

排除标准：（1）肥胖或严重营养不良病儿；（2）有精神疾病病儿；（3）血液系统疾病、免疫性疾病病儿；（4）近3 周内有感染性疾病史病儿；（5）心脏、脑等重要脏器严重病变病儿；（6）合并肺结核、哮喘等其他肺部疾病病儿。

CA-MPP 重症：符合CA-MPP 诊断，同时符合以下标准中（1）、（2）、（3）以及（4）、（5）中任意一项的病儿。（1）有明显的心动过速或气促，可伴或不伴有发绀及三凹征等；（2）使用大环内酯类抗生素＞1 周，但无效，或发热持续10 d 以上；（3）胸片示占据一个肺段或肺叶以上范围的大片阴影，可累及单叶或多叶病变；（4）伴有严重肺内并发症；（5）伴有严重低氧血症或其他脏器功能的严重损害。轻症：符合CA-MPP诊断，但不符合以上重症诊断标准［5］。

1.2 方法

1.2.1 MP-DNA 水平检测 （1）标本采集：入院2 h内，采用咽拭子采集所有病儿咽后壁拭取物，无菌试管保存，置于放有冰块的保温箱里，2 h内送检；取病儿肺泡灌洗液5 mL，置于放有冰块的保温箱里，即刻送检。（2）检测方法：咽拭子标本加入0.9%氯化钠溶液中，轻震荡后低温保存过夜，以12 000 r/min转速离心处理5 min 后取沉淀物，加入DNA 提取液50 µL，100 ℃条件下恒温处理10 min 左右，以12 000 r/min 转速离心处理5 min 后取沉淀物备用。取肺泡灌洗液标本，以同样方法提取DNA。取DNA标本，采用美国BIO-RADicycler 基因扩增仪进行聚合酶链式反应扩增，测定MP-DNA水平，试剂盒购自中山大学达安基因股份有限公司。（3）分组方法：根据咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 水平将92 例CAMPP 病儿分为低菌量组（MP-DNA＜103copies/mL，22 例）、中菌量组（MP-DNA 103～106copies/mL，42例）、高菌量组（MP-DNA＞106copies/mL，28例）。

1.2.2 血清炎性反应因子检测 采集所有病儿入院当天静脉血4 mL，以3 000 r/min 转速离心处理10 min后取血清，分成两份，置于-80 ℃冷藏室内待检，采用放射免疫分析法测定血清白细胞介素-18（IL-18）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平，以酶联免疫分析法检测血清C 反应蛋白（CRP）水平，试剂盒购自北京方程生物科技有限公司。

1.2.3 免疫功能指标检测 与血清炎性反应因子同时检测，取血清标本采用酶联免疫吸附试验测定血清免疫球蛋白A（IgA）、IgM、IgG水平，试剂盒购自北京方程生物科技有限公司。

1.3 观察指标 （1）观察不同病情程度病儿咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 水平。（2）观察不同菌量组血清CRP、TNF-α、IL-18、IgA、IgM、IgG 水平。（3）分析MP-DNA表达量与炎性反应、免疫功能的关系。

1.4 统计学方法 使用SPSS 23.0 进行研究资料分析。观察指标主要为计量数据，均通过正态性检验，以±s描述。两组比较为成组t检验或校正t检验。 多组比较为单因素方差分析+两两比较LSD-t检验。此外，相关分析为Pearson相关性分析。本研究统计推断的检验水准均为α=0.05。

2 结果

2.1 不同病情程度病儿咽拭子、肺泡灌洗液MPDNA 水平比较 重症病儿咽拭子、肺泡灌洗液MPDNA水平较轻症病儿高（P＜0.05），见表1。

表1 社区获得性肺炎支原体肺炎92例咽拭子、肺泡灌洗液肺炎支原体-DNA（MP-DNA）水平比较/±s

表1 社区获得性肺炎支原体肺炎92例咽拭子、肺泡灌洗液肺炎支原体-DNA（MP-DNA）水平比较/±s

组别重症组轻症组t值P值例数30 62咽拭子MP-DNA 5.68±0.73 5.14±0.51 5.27＜0.001肺泡灌洗液MP-DNA 6.87±0.85 5.70±0.63 4.72＜0.001

2.2 不同菌量组炎性反应因子水平比较 咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 高菌量组血清CRP、TNF-α、IL-18水平较中菌量组、低菌量组高（P＜0.05），见表2。

表2 社区获得性肺炎支原体肺炎92例不同菌量组炎性反应因子水平比较/±s

表2 社区获得性肺炎支原体肺炎92例不同菌量组炎性反应因子水平比较/±s

注：CRP为C反应蛋白，IL-18为白细胞介素-18，TNF-α为肿瘤坏死因子-α。①与低菌量组比较，P＜0.05。②与中菌量组比较，P＜0.05。

组别咽拭子MP-DNA高菌量组中菌量组低菌量组F值P值肺泡灌洗液MP-DNA高菌量组中菌量组低菌量组F值P值例数CRP/（g/L）TNF-α/（ng/L）IL-18/（ng/L）28 42 22 30.71±5.10①②22.77±3.67①11.29±2.34 157.85＜0.001 90.20±15.65①②78.37±12.70①64.01±10.13 23.79＜0.001 251.33±55.36①②204.15±42.08①②163.24±35.19 26.92＜0.001 264.09±58.17①②205.32±45.04①137.62±40.38 39.63＜0.001 33 35 24 34.10±8.14①②21.80±6.22①7.34±1.49 135.06＜0.001 95.37±17.03①②80.15±14.11①53.05±9.28 58.63＜0.001

2.3 MP-DNA表达量与炎性反应的关系 咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 表达量与血清CRP、TNF-α、IL-18呈正相关（P＜0.05），见表3。

表3 肺炎支原体-DNA（MP-DNA）表达量与炎性反应的关系（n=92）

2.4 不同菌量组免疫功能指标比较 咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 高菌量组血清IgA 较中菌量组、低菌量组低，IgM、IgG 较中菌量组、低菌量组高（P＜0.05），见表4。

表4 咽拭子、肺泡灌洗液肺炎支原体-DNA（MP-DNA）不同菌量组免疫功能指标比较/（g/L，±s）

表4 咽拭子、肺泡灌洗液肺炎支原体-DNA（MP-DNA）不同菌量组免疫功能指标比较/（g/L，±s）

注：①与低菌量组比较，P＜0.05。②与中菌量组比较，P＜0.05。

组别咽拭子MP-DNA高菌量组中菌量组低菌量组F值P值肺泡灌洗液MPDNA高菌量组中菌量组低菌量组F值P值例数IgA IgM IgG 28 42 22 0.93±0.13①②1.10±0.15①1.26±0.18 32.06＜0.001 1.57±0.32①②1.24±0.28①0.98±0.19 28.12＜0.001 8.81±1.20①②7.60±1.13①5.93±0.96 44.73＜0.001 9.31±1.27①②7.82±1.09①4.81±0.85 129.67＜0.001 33 35 24 0.83±0.10①②1.06±0.13①1.49±0.21 96.05＜0.001 1.62±0.34①②1.25±0.26①0.86±0.17 44.19＜0.001

2.5 MP-DNA表达量与免疫功能的关系 咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 表达量与血清IgA 呈负相关，与血清IgM、IgG呈正相关（P＜0.05），见表5。

表5 肺炎支原体-DNA（MP-DNA）表达量与免疫功能的关系（n=92）

3 讨论

CA-MPP发病率占肺炎的15%～30%，流行年高达40%～60%，肺部体征多不明显，起病缓慢，虽为自限性疾病，但近年来重症CA-MPP 病儿数量逐渐增多，治疗难度高，易引起肺外多系统受累，甚至威胁病儿生命［6-8］。因此，明确病儿病情，积极开展针对性治疗，对改善病儿预后具有重要影响。

近年来研究发现，MP 释放的毒素及毒性物质可直接对局部组织造成损害，多数学者认为MP 感染病儿病情严重程度与局部病菌量存在一定相关性［9-10］。方柯南等［11］针对44 例行支气管肺泡灌洗术的重症MPP 病儿的一项研究发现，得出病儿急性期咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 复制水平可作为病情评估的重要指标的结论。本研究通过对比不同病情程度CA-MPP 病儿的咽拭子、肺泡灌洗液MPDNA 水平，发现重症病儿上述指标水平显著高于轻症病儿，由此可见咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA水平与CA-MPP 病儿病情程度有关，有助于临床明确病儿病情。其机制是：MP-DNA水平体现MP局部病菌量和复制能力，其水平增高提示MP 局部病菌量增加，所释放的毒性物质相应增加，对病儿组织损伤加重，引起的症状更严重［12-13］。

关于MPP 发病机制的研究发现，细胞因子参与炎性反应、免疫反应及免疫损伤，抗炎系统和促炎系统对抗的结局，直接决定重症肺炎的临床转归［14］。MP 侵入机体后，刺激淋巴细胞大量分泌TNF-α、IL-18 等多种细胞因子，可促进病情进展、影响病儿预后［15］。本研究发现，CA-MPP 病儿咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 为高菌量的血清CRP、TNF-α、IL-18水平显著高于中菌量和低菌量病儿，与张晨宇等［16］、徐凤琴等［17］研究结果相近。其中TNF-α 为机体免疫防护的重要介质，在正常机体中活性较低，发挥调节免疫应答、促进细胞生成分化等生理功能，同时能参与机体免疫损伤，其水平大量增加可引起、促进炎症反应，加重组织、器官损伤。IL-18属于前炎症细胞因子，具有是促进Thl 细胞产生其他相关细胞因子的作用［18］。史晓云等［19］文献报道显示IL-18 是MPP 疾病进展过程中一项重要的细胞因子，可作为预测难治性MPP 的相关生物学指标。CRP 作为临床最常用炎性指标，其水平升高提示机体炎性反应程度加重［20］。进一步经相关性分析发现，咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 表达量与CA-MPP病儿血清CRP、TNF-α、IL-18 表达水平呈正相关，充分表明咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 可反映机体炎性反应情况。

此外，免疫反应在MPP 发生发展机制中发挥重要作用［21］。IgA、IgM、IgG 均为反映机体免疫功能的重要指标，本研究结果中，咽拭子、肺泡灌洗液MPDNA 表达量与CA-MPP 病儿血清IgA 水平呈负相关，与血清IgM、IgG 水平呈正相关，充分表明咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA 水平与CA-MPP 病儿免疫功能关系密切，可作为反映病儿免疫状态的重要指标。当MP 侵入机体后，可引发一系列免疫应答效应，不仅包括淋巴T 细胞的通过细胞因子介导的细胞免疫，也包括淋巴B 细胞通过IgA、IgM、IgG 等介导的体液免疫。MP 感染越严重，其引起IgA、IgM、IgG变化越明显。

综上可知，咽拭子、肺泡灌洗液MP-DNA水平异常增高参与CA-MPP 病儿病情进展，并与病儿炎性反应、免疫功能密切相关，可为病儿病情评估提供客观依据，有助于临床制定针对性治疗、干预措施。