热淋清片微生物限度检查方法学研究

刘靖华 刘艳平 陈明皓 张秀花

热淋清片为贵州苗药头花蓼单方制剂，具有清热解毒、利尿通淋功效，用于湿热蕴结、小便黄赤、淋漓涩痛之症，尿路感染、肾盂肾炎见上述证候者[1-4]，头花蓼提取物具有明显抗菌活性[5-9]，为治疗泌尿系统感染的有效药物。为消除药物抑菌性，增加污染菌检出效率，建立了热清淋片微生物限度检查稀释法。该方法操作简单，重现性好，可供其他实验室参考使用。

1 仪器与材料

1.1 样品

市售样品1，批号：20200501、20200301；市售样品2，批号：190801。

1.2 培养基

胰酪大豆胨琼脂培养基，批号：210829；胰酪大豆胨液体琼脂培养基，批号：210620；沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号：210626；均由北京陆桥技术股份有限公司提供。

1.3 稀释液

pH7.0 无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液，批号：210622，由北京陆桥技术股份有限公司提供。

1.4 菌株

金黄色葡萄球菌[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC（B）63501]、铜绿假单胞菌[CMCC（B）10104]、白色念珠菌[CMCC（F）98001]、黑曲霉[CMCC（F）98003]、大肠埃希菌[CMCC（B）44102]，均由中国食品药品检定研究院生物制品鉴定所提供。

1.5 仪器设备

电子天平（JE120，上海浦春计量仪器有限公司）、立式压力蒸气灭菌器（LDZX-50KBS，上海申安医疗器械厂）、生物安全柜（山东博科生物产业有限公司）、细菌培养箱（KB240，德国BINDER）。

2 方法与结果

2.1 菌液制备

按要求[10-11]将“1.4”项下菌株制成103cfu/ml的菌液备用。

2.2 供试液制备

取“1.1”项下样品10 g，加稀释液至100 ml，制成1∶10 供试液备用；取此供试液3 份，每份2 ml，分别加稀释液2、8、14 ml，制成1∶20、1∶50、1∶80 的供试液备用。

2.3 试验环境

在D 级背景下的A 级单向流空气的生物安全柜中进行。

2.4 微生物计数试验

试验组：取“2.2”项下供试液，加入“2.1”项下试验菌液，混匀，使每毫升供试液中含菌量不大于100 cfu；供试品对照组：取“2.2”项下供试液，以稀释液代替菌液同试验组操作；菌液对照组：以稀释液代替供试液，按试验组操作加入试验菌。

以上3 组分别取1 ml 注皿，照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1105[10]，需氧菌计数加入胰酪大豆胨琼脂培养基，霉菌酵母菌计数加入沙氏葡萄糖琼脂培养基，培养、计数，计算各试验菌回收率。

2.5 结果判断

计数方法适用性试验中，平皿法试验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2 范围内。

2.6 微生物计数结果

2.6.1 常规法热淋清片对5 种菌株均具有较强的抑菌作用，除需氧菌计数中黑曲霉外，其他各试验菌回收比均小于0.5，常规法不能消除样品中抑菌成分，需要进行进一步试验。见表1。

表1 常规法试验结果(n=3)

2.6.2 稀释法需氧菌计数可采用1∶80 供试液。见表2。霉菌酵母菌计数可采用1∶50 供试液。见表3。

表2 需氧菌计数试验结果(n=3)

表3 霉菌酵母菌计数试验结果(n=3)

2.7 控制菌检查

取胰酪大豆胨液体培养基100、150、200 ml 共3 份，分别加入1∶10 供试液10 ml，以大肠埃希菌为阳性对照，以稀释液为阴性对照，照《中华人民共和国药典》2020年版四部通则1107[11]，培养、选择和分离培养、结果判断。常规法可用于控制菌检查。见表4。

表4 控制菌检查结果(n=3)

2.8 微生物限度检查方法适用性试验

根据“2.6.1”、“2.6.2”及“2.7”项下确认的方法，对样品进行微生物限度检验方法适用性试验。3 批样品5 种菌株回收比均在0.5～2 范围内，阳性对照组检出阳性菌，符合药典要求。见表5。

表5 方法适用性验证试验结果

3 讨论

微生物污染受人、机、料、法、环等各个环节的影响，不同生产企业，因原料产地、生产工艺等不同，应分别进行微生物限度检查方法适用性试验[12]。

为确定样品的抑菌性大小，本试验从常规法入手，从表1可以看出，热清淋片具有极强的抑菌性，为确保污染菌的检出，必须首先消除样品的抑菌性。稀释法为经典的检验方法，操作简单、二次污染概率低，应首选稀释法进行再试验。从表2～3 可以看出，5 种菌株在不同培养基中抑菌性不同，需氧菌计数样品稀释80 倍，霉菌酵母菌计数样品稀释50 倍时，各试验菌回收比均在0.5～2 范围内，表明稀释法可用于微生物计数检查。

针对不同菌种，样品的抑菌性不同。从表4可以看出，热清淋片对控制菌并无抑菌性，常规法可用于控制菌检查。

在热淋清片微生物限度方法验证过程中，根据制剂的抑菌特性，建立了有效的验证方法，可保证检验结果准确，最大程度确保公众用药安全有效。