基于网络药理学探究桂冰腰痛栓治疗腰椎间盘突出症的作用机制

代 倩 蒋桓宇 冯银豪 杜霁航 金 龙 罗 建

腰椎间盘突出症是以腰椎间盘纤维环破裂，髓核压迫神经根，神经根出现水肿等病理改变为特征的一种常见临床疾病，以腰痛、下肢坐骨神经放射痛、行动受限等为主要症状[1]。治疗方法除手术外，非甾体类抗炎药，中药口服以及推拿手法、针灸都是临床常用且有效的方法。

桂冰腰痛栓是医院研发的院内制剂，由川乌、肉桂、姜黄、白芍、麝香、冰片组成，前期的临床研究表明桂冰腰痛栓配合推拿手法可以取得确切的临床效果[2]。但对于其具体的分子生物机制尚不明确，基于此，本研究使用网络药理学的研究方法对桂冰腰痛栓干预腰椎间盘突出症的分子生物学机制进行预测，以获得潜在的靶点、通路等信息，对未来的临床、动物研究提供一定的理论基础。

1 材料与方法

1.1 有效成分的获取和靶点的筛选

通过挖掘中药系统药理学数据库与分析平台（TCMSP）[3]寻找桂冰腰痛栓各中药的有效成分，满足口服利用度（OB）≥30%和类药性（DL）≥0.10的成分视为活性成分。由于TCMSP 未纳入人工麝香的有效成分，因此本研究通过查询文献的方法寻找该味药物的有效成分纳入研究。以得到的有效成分名称为关键词在PubChem数据库[4]下载其2D结构文件（sdf），将结构文件导入SwissTargetPrediction 数据库[5]进行靶点预测，得到桂冰腰痛栓的所有靶点。

1.2 腰椎间盘突出症的靶点筛选

以“Lumbar Disc Herniation”为关键词，通过GeneCards、TTD、Drugbank、OMIM[6-9]4 个数据库寻找和LDH 有关靶点，将得到的结果进行合并，去除重复值后得到腰椎间盘突出症有关的疾病靶点。

1.3 蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction,PPI）网络的的构建

使用TBtools[10]进行韦恩图的绘制，将桂冰腰痛栓有关靶点作为List1，腰椎间盘突出症有关靶点作为List2，取两者交集，得到两个List 的交集靶点，这一部分被视为桂冰腰痛栓治疗腰椎间盘突出症的的潜在靶点，因此需要获取这一部分靶点直接-间接的相互作用关系。将交集靶点导入String 数据库（https://string-db.org）[11]，设定物种为“Homo sapiens”，取中等“medium comfidence”以上的相互作用置信度（＞0.4），得到初步的PPI 网络，将结果以.tsv 格式导入Cytoscape 3.7.3 软件中进行分析和美化。在Cytoscape 软件中使用Networkanalyser 插件对PPI 网络进行分析得到各靶点的Degree 值、中心度，再通过Cytohubba 插件对PPI 网络进行分析得到各靶点的最大集团中心度（maximal clique centrality,MCC）值，根据MCC 值筛选出桂冰腰痛栓治疗腰椎间盘突出症的核心靶点。

1.4 基因本体（gene ontology,GO）富集分析和京都基因及基因组百科全书（koyoto encyclopedia of gene and genomes,KEGG）通路富集分析

将潜在治疗靶点导入Metascape 数据库[12]，设定物种为“Homo sapiens”进行GO 富集分析和KEGG通路分析，得到这些靶点的生物过程、细胞成分和分子功能，KEGG 通路信息。纳入P≤0.05 的项目，选择P值最低的15 个项目绘制圈图对结果进行可视化。将桂冰腰痛栓的有效成分、富集在关键通路上的靶点、关键通路的信息导入Cytoscape 软件建立成分-靶点-通路关系网络，并对该网络进行分析得到发挥作用的核心成分。

1.5 成分靶点通路网络图的构建

使用cytoscape软件将得到的15个最有可能是桂冰腰痛栓发挥治疗作用的通路和富集在这些靶点上的基因、与这些基因相关的有效成分这三者的关系绘制成网络图，并使用内置的Networkanalyser 对其进行分析得到网络相关的拓扑学参数，用以预测核心靶点和发挥药效的主要成分。

2 结果

2.1 桂冰腰痛栓和腰椎间盘突出症的靶点获取

在TCMSP 经过筛选有44 个成分满足OB≥30%，DL≥0.10，通过文献检索人工麝香获得8 个有效成分，共得到桂冰腰痛栓有效成分52 个。其中姜黄和肉桂具有一个相同的有效成分α-柏木烯。见表1。将44 个有效成分的化学结构文件导入Swiss Target Prediction 后获得1 925 个靶点，去除重复值后得到525 个靶点。基于GeneCards、TTD、Drugbank、OMIM 4 个数据库的数据挖掘得到腰椎间盘突出症相关基因431 个。随后使用TBtools 将两个靶点集合并取交集。见图1。得到交集靶点共54 个，这54 个基因被视为桂冰腰痛栓治疗腰椎间盘突出症的潜在靶点。

图1 桂冰腰痛栓和腰椎间盘突出症的靶点韦恩图

表1 桂冰腰痛栓有效成分

续表1

2.2 PPI 网络的构建和分析

将54 个交集靶点导入String 数据库中，得到的结果以.tsv 格式导入Cytoscape 进行分析和美化，得到桂冰腰痛栓治疗腰椎间盘突出的PPI 网络图，见图2。使用Cytohubba 分析该网络，得到MCC 最高的前10 个靶点作为PPI 网络的核心靶点，其中排名前10 的靶点依次为AKT1、VEGFA、IL-6、MMP9、TNF、PTGS2、MAPK1、MAPK8、MMP2、JUN。见图3。可以看出，使用MCC 值得到的10 个靶点和使用Degree 值预测的核心靶点有所不同，但大体一致。

图2 PPI 网络

图3 MCC 值最高的10 个核心基因

2.3 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析

使用Metascape 平台对54 个交集靶点进行生物富集分析，发现这54 个靶点参与1 560 个生物过程，富集于22 个细胞成分，具有77 个分子功能。根据Metascape 平台自动计算的P值，选取P值最低的前15 个条目以圈图的形式进行可视化。见图4。桂冰腰痛栓主要参加的生物学过程有肌肉细胞增殖、腺体发育、上皮细胞增殖、对脂多糖的应答、对细菌来源分子的应答、对平滑肌细胞增殖的正调控。这些靶点发挥作用的场所主要位于膜筏、膜微区、膜区等。相关靶点治疗腰椎间盘突出症的功能主要富集于丝氨酸水解酶活性、内肽酶活性、丝氨酸型内肽酶活性、丝氨酸型肽酶活性等。

图4 GO 富集分析和KEGG 通路富集分析结果

KEGG 通路富集分析共得到146 条通路，其中P值最低的通路为肿瘤坏死因子通路、松弛素信号通路、脂质和动脉粥样硬化、白细胞介素-17 信号通路等。

2.4 成分靶点网络

使用Cytoscape 3.7.2 软件构建出桂冰腰痛栓-靶点-通路网络图。雄激素受体（androgen receptor,AR）的Degree 值为29，betweenness 为0.32，closeness为0.41，因此根据Degree 值预测AR 为相对重要的靶点，SLC6A4、MAPK14、ESR1、AKT1 等亦为重要的靶点。亚油酸Degree 值最高为9，betweenness为0.10，closeness 为0.42，因此桂冰腰痛栓治疗腰椎间盘突出症的主要成分为亚油酸。其次为α-柏木烯（(-)-alpha-cedrene），其Degree 值为6，betweenness为0.0039，closeness 为0.32。见图5。

图5 桂冰腰痛栓治疗腰椎间盘突出症的成分靶点网络

3 讨论

本研究使用网络药理学的方法预测出桂冰腰痛栓治疗腰椎间盘突出症的主要有效成分可能为亚油酸、α-柏木烯、油酸、β-谷甾醇。亚油酸是人类饮食中摄取最多的多不饱和脂肪酸，作为磷脂膜的主要结构成分之一在维持膜结构稳定性中发挥关键作用。近期研究表明，大剂量的亚油酸可以有效逆转棕榈酸诱导的小胶质细胞的炎症反应[13]。共轭亚油酸可通过调节环氧化酶-2（COX-2）的活性和表达以影响前列腺素E2（PGE2）的合成，从而增加骨形成率，缓解炎症[14]。α-柏木烯作为一种MOR23 的天然配体，可以减轻游离脂肪酸诱导的骨骼肌管的萎缩，增加肌管直径、融合指数和细胞总蛋白含量；而敲除MOR23 后增强骨骼肌强度和质量的效应明显减弱[15]。β-谷甾醇可以通过抑制NF-κB 通路和激活HO1/Nrf-2 通路以降低NF-κB、RANKL、STAT3 水平，从而影响炎症介质IL-1β、IL-16、TNF-α、IL-6水平而缓解小鼠的关节炎症[16]。

本研究结果表明AKT1 是桂冰腰痛栓治疗腰椎间盘突出症的潜在靶点。AKT1 是一种受磷脂酰肌醇-3-激酶（PI3K）信号调节的丝氨酸-苏氨酸激酶，可以抑制神经元凋亡[17]。AKT1 在调节神经元细胞大小和存活方面具有多种作用[18]，包括加速轴突再生，促进轴突伸长和分支等。因此推测桂冰腰痛栓可通过调节AKT1 以改善腰椎间盘突出造成的神经损伤以及促进神经修复。

炎症反应在腰椎间盘突出症中发挥着重要的作用，TNF 是一种参与全身系统性炎症的重要细胞因子之一，TNF-α 可以上调多种细胞黏附分子如细胞间黏附分子-1（ICAM-1）、血管细胞黏附分子1（VCAM-1）等从而促进炎症发生[19-20]。本研究预测出的其他几个重要基因包括VEGFA、IL6、TNF 等都参与了炎症介质的产生过程，调控炎症应是桂冰腰痛栓治疗腰椎间盘突出症的重要机制。

综上所述，桂冰腰痛栓具有多种有效成分，且多种有效成分可以调控多个基因，参与多个信号通路，且这些有效成分、基因、通路之间的关系并非一一对应，而是相互交错形成复杂的网络关系，这体现了中医药治疗疾病的多靶点、多通路的关系。同时，这也为进一步研究中医药的分子生物学机制提供了理论基础。本研究的局限性在于网络药理学本身基于计算机科学和数据库的挖掘，不能纳入未知有效成分如中药复方制剂生产过程中产生的化学物质，以及未知的有效成分-基因-通路之间的关系。因此需要在此基础上进一步筛选动物、细胞实验验证从而明确桂冰腰痛栓治疗腰椎间盘突出症的作用机制。