miR-144-3p通过调控ABCG2信号通路对膀胱癌细胞增殖、凋亡及迁移作用的影响

陶涛 任承德 陈国俊 强紫阳 杨艳燕

(青海大学附属医院泌尿外科，青海 西宁 810001)

膀胱癌在我国的临床发病率为泌尿系统肿瘤首位，且术后的复发率高达60%以上。常用临床治疗方法有外科手术、化疗及放疗，膀胱癌的初期这些治疗方法结合治疗取得相对乐观的疗效，而由于膀胱癌细胞具有增殖凋亡不受控、易发生转移的特点，患者在病情严重时，临床治愈率显著降低且预后不佳〔1～3〕。因此，膀胱癌细胞的恶性增殖迁移及非正常凋亡是影响临床治疗效果的关键因素，而在现阶段对于癌细胞失控行为的具体机制尚在研究阶段，可以明确的是，这是多细胞因子共同调控的结果，围绕膀胱癌细胞的发展机制展开深入探究对于临床治疗和患者生存率的提高均具有重大意义〔4〕。miRNA是近年来研究较多的非编码RNA，其种类众多且被发现能够参与细胞的增殖、发育、分化 、凋亡、转移等生物学行为和过程〔5〕。相关研究证明，miR-144-3p能够对骨肉瘤细胞增殖、侵袭能力进行抑制，且低表达于胰腺癌细胞中，上调其表达能够有效降低胰腺癌细胞的转移侵袭效率，此外，miR-144-3p还被证明能够通过调控丝裂原活化蛋白激酶激酶激酶(MAP3K)8通路发挥肾细胞癌抑癌基因作用，因此，miR-144-3p在膀胱癌细胞发展过程的作用也值得探究〔6,7〕。三磷酸腺苷(ATP)结合转运蛋白G家族成员(ABCG)2被发现与胃癌、肠癌、食管癌等多种肿瘤临床预后有关〔8,9〕，吕弢等〔10〕发现miR-144-3p能够靶向调控ABCG2通路的表达抑制胃癌细胞的迁移侵袭。本研究旨在探究miR-144-3p通过调控ABCG2通路对膀胱癌细胞增殖、凋亡及迁移作用的影响。

1 材料与方法

1.1试验材料 人膀胱癌T24细胞株、正常膀胱上皮SV-HUC-1细胞株(南京科佰生物科技有限公司)、DMEM培养基(南京生航生物技术有限公司)、0.05%胰酶溶液(武汉普诺赛生命科技有限公司)、逆转录试剂盒(武汉默沙克生物科技有限公司)、CCK-8试剂(北京缘生化科技有限公司)、结晶紫染液(湖北鑫鸣泰化学有限公司)、ABCG2一抗、ABCG2二抗(上海晶抗生物工程有限公司)、明胶酶谱检测试剂盒(上海信帆生物科技有限公司)、考马斯亮蓝染液(上海哈灵生物科技有限公司)、Transwell小室(北京优尼康生物科技有限公司)、流式细胞仪、高速离心机(美国贝克曼)、倒置显微镜(广州明美光电技术有限公司)。

1.2试验方法

1.2.1细胞培养 将人膀胱癌T24细胞株和正常膀胱上皮SV-HUC-1细胞株分别接种在含有10%小牛血清DMEM培养基的不同培养瓶中，然后放置在CO2浓度为5%室温且湿度条件适宜的培养箱进行培养，两种细胞的融合度达到80%以上添加浓度为0.25%的胰酶进行细胞的消化，消化后的细胞传代培养3代后备用。

1.2.2细胞转染与分组 将传代培养结束的T24细胞接种于6孔板(密度为1×104/孔)，并于培养箱培养1 d，细胞融合度达到50%时按照Lipofectamine 2000说明开始转染操作，将细胞分为三组：转染miR-144-3p模拟物的T24细胞为miR-144-3p mimics组；转染miR-144-3p抑制剂的T24细胞为miR-144-3p inhibitor组；转染无意义序列的T24细胞为miR-144-3p NC组，转染操作完成后将细胞培养于不含小牛血清DMEM培养基上继续培养。

1.2.3qPCR法检测miR-144-3p表达 qPCR法检测T24和SV-HUC-1细胞中miR-144-3p表达及转染步骤完成后各组T24细胞中miR-144-3p的表达。首先进行总RNA的提取，再根据逆转录试剂盒的具体操作完成cDNA的合成，U6为内参进行qPCR检测，反应条件为：95℃ 2 min、95℃ 30 s、70℃ 40 s、70℃ 50 s，共进行35个循环后70℃ 10 min。以2-△△Ct法进行miR-144-3p相对表达的计算，各组设3个复孔进行3次重复试验取平均值。

1.2.4CCK-8检测细胞增殖 按密度为1×104/孔接种各组细胞于96孔板上，并分别于培养的0、24、48、72 h时添加CCK-8试剂进行染色，室温孵育1 h后对每孔490 nm处OA值进行测定，各组设3个复孔进行3次重复试验取平均值，并进行细胞增殖曲线的绘制。

1.2.5流式细胞仪检测细胞凋亡 将各组T24细胞进行1 000 r/min转速离心10 min，磷酸盐缓冲液(PBS)试剂反复清洗，结合缓冲液进行清洗后1 000 r/min转速离心10 min，重悬细胞后避光条件下添加5 μl 的膜联蛋白(Annexin)V，作用10 min后添加5 μl 7-氨基放线菌素(AAD)，在1 h之内使用流式细胞仪检测检测细胞凋亡率。

1.2.6Transwell检测细胞迁移 各组T24细胞进行转染48 h时用胰酶消化，经过重悬制单细胞悬液，以5×103/孔T24细胞铺于Transwell上室，下室培养基中添加20%小牛血清，将小室于培养箱中孵育1 d后取出小室，棉签擦去上室的细胞和碎片，以0.1%的结晶紫染液对细胞进行染色，PBS洗涤后用倒置显微镜观察下室滤膜上黏附的T24细胞，统计穿膜细胞数，比较各组细胞的迁移能力。

1.2.7Western印迹检测ABCG2蛋白表达 提取总蛋白后二喹淋甲酸(BCA)法定量后以40 μg样品上样，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行蛋白分离，经转膜后添加5%脱脂奶粉室温孵育2 h，添加ABCG2一抗后低温孵育过夜后添加ABCG2二抗孵育1 h，进行显色曝光、采集图像，以GAPDH为内参运用Gel-Pro32软件分析T24细胞中ABCG2相对表达。

1.2.8明胶酶谱检测基质金属蛋白酶(MMP)-2、MMP-9活性 通过明胶酶谱检测试剂盒检测MMP-2及MMP-9的活性。将各组T24细胞进行转染48 h时的培养上清液与SDS上样缓冲液进行混合，进行凝胶电泳的条件为电压70 V电泳时长2 h，电泳结束后用3.0%的Tritonx洗胶。然后于分析液中孵育过夜，考马斯亮蓝染色2 h后于脱色液中进行0.5 h的脱色，再以浓度为0.8%的乙酸脱色，最后明胶酶活性于蓝色背景出现光亮区域。

1.3统计学处理 采用SPSS18.0软件进行t检验、F检验。

2 结 果

2.1不同细胞中miR-144-3p、ABCG2的表达 miR-144-3p在人膀胱癌T24细胞中的表达较正常膀胱上皮SV-HUC-1细胞显著降低(0.51±0.05 vs 1.31±0.07；t=6.347，P<0.05)；ABCG2在人膀胱癌T24细胞中的表达较正常膀胱上皮SV-HUC-1细胞显著升高(3.12±0.34 vs 0.99±0.10；t=6.836，P<0.05)。

2.2转染后各组miR-144-3p的表达 经检验，转染后miR-144-3p mimics组膀胱癌T24细胞中miR-144-3p的表达(1.36±0.05)较miR-144-3p NC组显著升高(0.52±0.04，P<0.05)；miR-144-3p inhibitor组膀胱癌T24细胞中miR-144-3p的表达(0.37±0.03)较miR-144-3p NC组显著降低(P<0.05)。

2.3各组T24细胞增殖能力比较 在转染后的24、48、72 h时，各组膀胱癌T24细胞的增殖能力有统计学差异(均P<0.05)，与miR-144-3p NC组比较，miR-144-3p mimics组细胞的增殖能力显著降低(P<0.05)，miR-144-3p inhibitor组细胞的增殖能力显著上升(P<0.05)。见表1。

2.4各组T24细胞凋亡率比较 miR-144-3p mimics组T24细胞凋亡率〔(49.11±9.29)%〕较miR-144-3p NC组显著升高〔(16.28±3.77)%,P<0.05〕；miR-144-3p inhibitor组T24细胞凋亡率〔(5.21±0.63)%〕较miR-144-3p NC组显著降低(P<0.05)。见图1。

表1 各组转染不同时间A值比较

2.5各组T24细胞迁移能力比较 miR-144-3p mimics组T24细胞迁移个数〔(64.12±5.28)个〕较miR-144-3p NC组显著降低〔(105.48±12.16)个，P<0.05〕；miR-144-3p inhibitor组T24细胞迁移能力〔(204.39±20.19)个〕较miR-144-3p NC组显著上升(P<0.05)。见图2。

图1 各组T24细胞的流式细胞凋亡图

图2 细胞迁移能力显微镜下观察(结晶紫染色，×100)

2.6各组ABCG2信号通路蛋白的表达 miR-144-3p mimics组T24细胞中ABCG2、MMP-2、MMP-9的表达较miR-144-3p NC组显著降低(P<0.05)；miR-144-3p inhibitor组T24细胞ABCG2、MMP-2、MMP-9的表达较miR-144-3p NC组显著上升(P<0.05)。见表2、图3、4。

表2 各组ABCG2信号通路蛋白的相对表达比较

1～3：miR-144-3p inhibitor组、miR-144-3p NC组、miR-144-3p mimics组，下图同图3 Western印迹检测T24细胞中ABCG2蛋白表达

图4 明胶谱试验检测T24细胞中MMP-9、MMP-2的表达

3 讨 论

近年来，miRNA被研究证实其在机体的多种病理及生理过程中起到关键调控作用，不同种类的miRNA对肿瘤恶性疾病发挥的作用不一，并与相关调节蛋白相互作用正向或负向调控着肿瘤细胞的代谢、增殖、转移〔11～15〕。miR-144-3p是miRNA众多种类中的一种，经过对其深入和广泛的研究，发现其在癌症发生、成骨分化、生长发育及机体免疫反应等过程中均有一定的调控作用，高表达的miR-144-3p能够抑制胃癌、恶性胶质瘤病、宫颈癌在内的多种癌细胞的增殖及迁移侵袭行为〔16～18〕。ABCG2作为多种肿瘤的临床检测标志物，被发现其在胃癌和胶质瘤干细胞中的表达显著升高，并且与食管癌的病程发展和肿瘤分期关系密切，其下游MMP-2、MMP-9是MMP家族的成员，其促进癌细胞转移侵袭能力已得到多项研究的证实〔19，20〕。

本研究说明miR-144-3p的低表达可能是膀胱癌的致病因素之一。ABCG2的高表达对于该病有促进作用。膀胱癌细胞中miR-144-3p的高表达能够抑制细胞的增殖、促进肿瘤细胞的凋亡、抑制细胞的迁移能力。miR-144-3p对于膀胱癌细胞的一系列调控作用与其高表达抑制ABCG2通路表达有关。