miR-134/CREB/BDNF通路在低频重复经颅磁刺激影响癫痫大鼠抑郁、焦虑样行为中的作用

宋晋 梁婷 王强 陈绘景

(1武汉科技大学医学院，湖北 武汉 430065；2武汉市精神卫生中心)

癫痫是一种慢性大脑短暂性功能障碍，患者反复发作会出现抑郁、焦虑等精神问题，严重影响患者身心健康及生活质量〔1,2〕。目前癫痫治疗仍以药物为主，但仍有20%～30%癫痫患者经药物治疗无效，因此探索安全、无创的有效抗癫痫手段至关重要。低频重复经颅磁刺激(rTMS)是一种新型无痛、无创性抗癫痫技术，可降低癫痫患者发作频率、减轻抑郁样行为〔3～5〕，但其具体作用机制尚不完全明确。研究发现，异常突出形成可能与癫痫发生发展有关，位于突触后成分中的树突棘形成和降解动态变化是突触可塑性的标志，而微小RNA(miR)-134与树突棘的发育有关，对神经可塑性起重要作用，可参与癫痫及脑神经疾病的发生发展〔6,7〕。环腺苷酸应答元件结合蛋白(CREB)是神经可塑性重要调节因子，脑源性神经营养因子(BDNF)是CREB经典下游靶基因，对多种神经元具有营养、成熟等作用，可促进神经元的可塑性及神经递质的形成，与抑郁、焦虑样行为及认知障碍等密切相关〔8～10〕，但关于rTMS抗癫痫作用是否与调节miR-134/CREB/BDNF通路有关鲜有研究。本研究拟探究rTMS对癫痫大鼠抑郁、焦虑样行为及miR-134/CREB/BDNF通路的影响，以期揭示其作用机制。

1 材料与方法

1.1实验动物 健康成年雄性清洁级SD大鼠36只，体重280～300 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。于本院实验动物房环境温度(23±2)℃、湿度(60±5)%，12 h昼夜节律控制条件下饲养，自由饮水、采食。

1.2主要试剂及仪器 氯化锂(货号：L4408，纯度≥99.0%)购自Sigma-Aldrich公司；硫酸阿托品(国药准字H20073819)购自河南普瑞制药有限公司；毛果芸香碱(货号：92-13-7)购自湖北诺纳科技有限公司；Trizol试剂(货号：R0016)、蛋白抽提试剂盒(货号：P0028)、二喹啉甲酸(BCA)蛋白定量试剂盒(货号：P0010S)均购自上海碧云天公司；miR定量试剂盒(货号：638315)、PrimeScriptTMRT reagent Kit(货号：RR037A)、TB Green® Premix Ex TaqTMⅡ(货号：RR820A)均购自TaKaRa公司；引物由上海吉玛生物科技有限公司合成；兔源一抗anti-CREB(货号：ab31387)、anti-p-CREB(货号：ab220798)、anti-BDNF(货号：ab108319)、anti-β-actin(货号：ab-179467)、二抗羊抗兔IgG(货号：ab6721)均购自英国Abcam公司；Evolution 220紫外分光光度计、MODEL550型酶标仪均购自美国Thermo公司；7500荧光定量-聚合酶链反应(RT-qPCR)仪购自美国Bio-Rad公司等。

1.3方法

1.3.1分组及癫痫大鼠模型制备 36只大鼠随机分为正常对照组(NC组)、假刺激组(s-rTMS组)及rTMS组，每组12只。NC组为正常饲养未进行任何刺激正常大鼠；rTMS组大鼠行rTMS刺激，刺激参数：0.75 Hz，75%阈强度，20次/串，5串/d；s-rTMS组给予次数相同、声音相似的假性刺激，均连续7 d。7 d后s-rTMS组及rTMS组腹腔注射氯化锂127 mg/kg，16～20 h后注射毛果芸香碱35 mg/kg，注射毛果芸香碱前30 min注射阿托品1 mg/kg，根据Racine分级〔11〕(0级：无任何反应；Ⅰ级：面部阵挛，包括眨眼、动须、节奏性咀嚼等；Ⅱ级：Ⅰ级反应+节律性点头；Ⅲ级：Ⅱ级反应+前肢阵挛；Ⅳ级：Ⅲ级反应+后肢站立；Ⅴ级：Ⅳ级反应+摔倒)观察大鼠癫痫发作程度，连续3次达到Ⅳ～Ⅴ级发作即被认为癫痫持续状态(SE)即造模成功，SE点燃1 h后腹腔注射地西泮10 mg/kg终止发作。NC组大鼠腹腔注射等量生理盐水代替毛果芸香碱，其余处理同s-rTMS组及rTMS组。

1.3.2抑郁样行为学检测 采用强迫游泳实验及旷场实验检测大鼠抑郁样行为。(1)强迫游泳实验：准备圆柱形透明玻璃容器，直径20 cm，高50 cm，水温23～25 ℃，水深35 cm，使得大鼠在其中不能靠四肢或尾巴支撑桶底而把头露出水面呼吸。实验前1 d进行15 min适应性训练。实验时将大鼠置于容器内，记录其在5 min内累积不动时间，其中“不动”标准为：漂浮在水中不挣扎或仅保持头部在水面以上或接触水池底部超过1 s。(2)旷场实验：将大鼠放入80 cm×80 cm×40 cm的黑色敞箱中，箱底均匀划分5 cm×5 cm小格，每次从同一方向放入，记录大鼠5 min内水平站立次数及垂直站立次数。

1.3.3焦虑样行为学检测 分别采用高架十字迷宫实验及新颖环境抑制摄食测试检测大鼠焦虑样行为。(1)高架十字迷宫实验：将大鼠置于标准高架迷宫正中央，头超封闭壁，使大鼠自由探索5 min，记录大鼠进入开放臂次数(OE)、封闭臂次数(CE)及封闭臂停留时间(CT)、开放臂停留时间(OT)，计算总穿臂次数(TE)：OE+CE；进入开放臂次数的比例(OE%)：OE/(OE+CE)× 100%；开放臂停留时间比例(OT%)：OT/(OT+CT)×100%。(2)新颖环境抑制摄食测试：利用大鼠喜欢趋边特性，检测焦虑样行为。大鼠禁食24 h后，保持实验环境安静，然后将大鼠放入顶部开放、底部划分为大小均匀的15 cm× 15 cm方格木质箱子的角落，中间摆放一颗食物，摄像头记录10 min内大鼠从放进盒子里到准备进食的摄食潜伏期，以此作为评价焦虑样行为的指标。

1.3.4海马miR-134、CREB及BDNF mRNA相对表达量检测 各组大鼠腹腔注射3.5%水合氯醛1 ml/kg麻醉处死后断头取脑，分离海马组织。采用Trizol试剂提取总RNA，浓度和纯度检测合格后反转录得到cDNA，置于-80℃中保存备用。采用RT-qPCR扩增miR-134、CREB及BDNF mRNA片段。引物序列：miR-134：上游：5′-GGGTGTGACTGGTTGAC-3′，下游：5′-CACAGCTCGTAGAACAGGAGG-3′；U6：上游：5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′，下游：5′-CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；CREB：上游：5′-CCACTCAGCCGGGTACTACC-3′，下游：5′-CACCAGAGGCAGCTTGAACA-3′；BDNF：上游：5′-GCTGCTGGATGAGGACCAGA-3′，下游：5′-CCAAAA-GGCACTTGACTGCTG-3′;GAPDH：上游：5′-GTCG-ATGGCTAGTCGTAGCATCGAT-3′，下游：5′-TGCTA-GCTGGCATGCCCGATCGATC-3。RT-qPCR采用20 μl反应体系：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μl，ROX Reference Dye or Dye Ⅱ(50×)0.4 μl，cDNA(50 ng/μl)2 μl，上下游引物(10 μmol/L)各0.8 μl，ddH2O 6.0 μl。反应条件为：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40个循环。采用2-ΔΔCt法分析miR-134、CREB及BDNF mRNA相对表达量。

1.3.5海马CREB、p-CREB、BDNF蛋白表达量检测 Western印迹检测各组大鼠海马CREB、p-CREB、BDNF蛋白表达情况。采用蛋白抽提试剂盒提取海马总蛋白，BCA试剂盒检测蛋白浓度，置于-80℃保存备用。取50 mg蛋白样品，80 mV电压下6%十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)2 h，250 mA下聚偏氟乙烯(PVDF)膜转膜70 min。5%脱脂奶粉室温封闭2 h，加入适量含2%脱脂奶粉的磷酸盐缓冲液(PBS)稀释，加一抗anti-CREB(1∶1 000)、anti-p-CREB(1∶1 000)、anti-BDNF(1∶5 000)、anti-β-actin(1∶5 000)4℃孵育过夜，TBST缓冲液洗膜3次，每次20 min，添加二抗IgG(1∶5 000)37℃孵育1.5 h，显色，曝片，观察并分析各蛋白条带灰度值。

1.4统计学方法 采用SPSS25.0软件进行单因素方差分析、t检验。

2 结 果

2.1rTMS对癫痫大鼠抑郁样行为的影响 与NC组比较，s-rTMS组不动时间显著延长，水平站立次数及垂直站立次数显著减少(P<0.05)；与s-rTMS组比较，rTMS组不动时间显著缩短，水平站立次数及垂直站立次数显著增加(P<0.05)，见表1。

2.2rTMS对癫痫大鼠焦虑样行为的影响 与NC组比较，s-rTMS组TE、OE%、OT%显著减少，摄食潜伏期显著延长(P<0.05)；与s-rTMS组比较，rTMS组TE、OE%、OT%显著增加，摄食潜伏期显著缩短(P<0.05)，见表1。

表1 各组抑郁样、焦虑样行为比较

2.3rTMS对癫痫大鼠海马miR-134、CREB及BDNF mRNA相对表达量的影响 与NC组比较，s-rTMS组miR-134相对表达量显著降低，CREB及BDNF mRNA相对表达量显著增加(P<0.05)；与s-rTMS组比较，rTMS组miR-134相对表达量显著增加，CREB及BDNF mRNA相对表达量显著降低(P<0.05)，见表2。

2.4rTMS对癫痫大鼠海马CREB、p-CREB及BDNF蛋白表达量的影响 与NC组比较，s-rTMS组p-CREB/CREB及BDNF蛋白表达量显著增加(P<0.05)；与s-rTMS组比较，rTMS组p-CREB/CREB及BDNF蛋白表达量显著降低(P<0.05)，见图1、表3。

表2 各组海马miR-134、CREB及BDNF mRNA相对表达量比较

图1 Western印迹检测海马CREB、p-CREB及BDNF蛋白表达

表3 各组海马p-CREB/CREB及BDNF蛋白表达量比较

3 讨 论

癫痫反复发作可导致神经元坏死和凋亡、特异性突触重塑、苔藓纤维出牙等，进而可促进异常兴奋性环路形成，发展为难治性癫痫〔12〕。近来rTMS成为抗癫痫的潜在治疗手段，但文献报道中rTMS治疗癫痫的刺激参数各不相同，rTMS调节皮质兴奋性效应与刺激频率有关，通常高频(>1 Hz)可增强皮质兴奋性，而低频(≤1 Hz)可抑制皮质兴奋性〔13,14〕，Li等〔15〕研究报道，长期间歇性低频率rTMS可有效控制不服药青少年癫痫患者的癫痫发作。Wang等〔16〕研究报道，低频rTMS治疗可改善癫痫大鼠抑郁、焦虑状态，但不能减轻其癫痫发作程度。而有研究报道对右顶叶皮层的1 Hz rTMS会干扰短暂出现刺激的感知〔17〕。本研究结果提示癫痫大鼠出现抑郁、焦虑样行为，模型制备成功，可用于后续试验；提示rTMS可显著改善癫痫大鼠抑郁及焦虑样行为，有一定临床应用价值，但对癫痫伴抑郁、焦虑样行为障碍的影响及作用机制尚无明确定论。

miR-134是一种广泛分布于脑内海马特殊小RNA，可调节神经元的微观结构及树突棘大小，与癫痫等神经系统疾病密切相关。王倩等〔18〕研究报道，难治性癫痫患者颞叶皮质及癫痫动物海马中miR-134表达下降，CREB、p-CREB表达升高。Zhu等〔19〕研究报道，癫痫病大鼠海马miR-134水平在3 d后明显低于正常水平，并继续维持在较低水平；而CREB和p-CREB水平在3 d后显著升高，并继续保持在较高水平，miR-134可通过抑制CREB和p-CREB表达抑制突触可塑性。而Shen等〔20〕研究报道，白藜芦醇对温和应激诱导的认知障碍神经保护作用可能与下调miR-134、上调沉默调节蛋白(SIRT)1激活SIRT1/miR-134通路，进而上调其下游海马区CREB/BDNF表达有关。另Chen等〔21〕研究报道，单唾液酸神经节苷脂通过上调SIRT1、p-CREB、BDNF表达激活发育中的雄性大鼠海马中SIRT1/CREB/BDNF通路，改善铅诱导的认知缺陷和脑损伤。本研究结果发现，与NC组比较，s-rTMS组miR-134相对表达量显著降低；与s-rTMS组比较，rTMS组miR-134相对表达量显著增加。CREB是核转录因子，被磷酸化活化后可进一步激活其下游靶基因BDNF表达，影响神经元的可塑性及递质合成，CREB/BDNF信号通路是抑郁样行为及认知功能障碍性疾病中重要相关通路〔22〕。提示低频rTMS可抑制癫痫大鼠抑郁、焦虑样行为可能与调控miR-134/CREB/BDNF通路有关，但miR-134是直接靶向CREB/BDNF通路还是通过靶向SIRT1间接影响CREB/BDNF通路在抑郁、焦虑样行为中起作用有待进一步验证。

综上，低频rTMS可减轻癫痫大鼠抑郁、焦虑样行为，可能与调控miR-134/CREB/BDNF通路有关。