基于生物信息学分析E74样转录因子3在卵巢浆液性囊腺癌中的表达及作用机制

崔涵 张春雷 刘文珍

卵巢癌是女性最常见的恶性肿瘤之一。卵巢癌患者手术治疗后易复发且生存率较低[1]，临床缺乏高灵敏度、高特异度的卵巢癌生物标志物[2]。卵巢浆液性囊腺癌是卵巢癌最常见的病理类型，其病因尚未完全明确，治疗方案也有待临床进一步探索[3]。E74样转录因子3（E74-like transcription factor 3,ELF3）是上皮特异性转录因子之一，其遗传改变和表达失调与多种上皮癌的进展有关[4]。目前，ELF3在卵巢浆液性囊腺癌中的研究报道少见。基于此，本研究采用生物信息学分析癌症基因组图谱数据库（The Cancer Genome Atlas,TCGA）中的卵巢浆液性囊腺癌样本数据，并将结果在基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus,GEO）中进行验证，探讨ELF3在卵巢浆液性囊腺癌中的表达情况，并分析其对卵巢浆液性囊腺癌诊断、预后评估的临床价值及可能的作用机制，现报道如下。

1 材料和方法

1.1 数据和样本来源 提取TCGA中2006至2021年内收录的且具有临床信息数据的379例卵巢浆液性囊腺癌组织样本和88例正常卵巢组织样本的临床信息和ELF3表达数据，选取TPM格式的RNAseq数据并进行log2转化后进行样本间的表达比较。获取GEO的GSE38666数据集中12例患者正常卵巢上皮细胞及18例患者卵巢浆液性囊腺癌上皮细胞的测序结果进行ELF3 mRNA表达水平验证，利用RMA方法对测序结果进行标准化。免疫组化结果来源于人类蛋白图谱数据库（The Human Protein Atlas,HPA）。本研究所用数据均为公共数据库数据，符合医学伦理。

1.2 生物信息学分析 采用R 3.6.3软件对TCGA、GEO数据库中组织样本及细胞测序结果中基因表达情况进行统计分析与可视化，并对差异表达基因进行基因集富集分析（gene set enrichment analysis,GSEA），探索可能的作用机制。GSEA分析中，显著富集的阈值为错误发现率（false discovery rate,FDR）＜0.25且P＜0.05。

1.3 临床信息分组 卵巢浆液性囊腺癌患者根据年龄分为≤60岁和＞60岁；根据国际妇产科协会（International Federation of Obstetrics and Gynecology,FIGO）等级分为Ⅰ～Ⅳ级；根据初始治疗效果分为疾病进展（progressive disease,PD）、疾病稳定（stable disease,SD）、部分缓解（partial response,PR）、完全缓解（complete response,CR）；根据种族分为亚裔、非洲裔和白人；根据组织学分级分为G1～4，分别为高分化、中分化、低分化及未分化；根据肿瘤发生部位分为双侧、单侧；根据血管侵犯情况分为否和是，根据淋巴结侵犯情况分为否和是，根据肿瘤残留情况分为否和是；根据ELF3 mRNA中位表达水平，分为ELF3 mRNA高表达、低表达。

1.4 统计学处理 采用R 3.6.3统计软件。非正态分布的计量资料比较采用Mann-WhitneyU检验；采用ROC曲线评估ELF3 mRNA表达水平对卵巢浆液性囊腺癌的诊断价值；采用Kaplan-Meier法绘制生存曲线，两组患者生存曲线的比较采用log-rank检验。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 卵巢浆液性囊腺癌患者临床资料 纳入本研究的卵巢浆液性囊腺癌患者样本共379例，年龄51～68岁，中位年龄59岁，其中≤60岁208例（54.9%），＞60岁171例（45.1%）；FIGO Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ级分别1例（0.3%）、23例（6.1%）、295例（77.8%）、57例（15.0%），3例（0.8%）不详；初始治疗效果PD、SD、PR、CR分别27例（7.1%）、22例（5.8%）、43例（11.3%）、216例（60.1%）例，71例（18.7%）不详；亚裔、非洲裔和白人分别12例（3.2%）、25例（6.6%）、328例（86.5%），14例（3.7%）不详；组织学分级G1、G2、G3、G4分别 1例（0.3%）、45例（11.9%）、322例（85.0%）、1例（0.3%），10例（2.5%）不详；肿瘤发生部位单侧、双侧分别102例（26.9%）、255例（67.3%），22例（5.8%）不详；血管侵犯否和是分别41例（10.8%）、64例（16.9%），274例（72.3%）不详；淋巴结侵犯否和是分别48例（12.7%）、101例（26.6%），230例（60.7%）不详；肿瘤残留否和是分别67例（17.7%）、268例（70.7%），44例（11.6%）不详；总生存（overall survival,OS）例数和死亡例数分别147例（38.8%）、232例（61.2%）；疾病特异性生存（disease free survival,DSS）例数和非卵巢癌因素死亡例数分别154例（40.6%）、200例（52.8%），25例（6.6%）例不详。

2.2 卵巢浆液性囊腺癌组织与正常卵巢组织、卵巢浆液性囊腺癌上皮细胞与正常卵巢上皮细胞ELF3表达情况比较 卵巢浆液性囊腺癌组织ELF3 mRNA表达水平高于正常卵巢组织（P＜0.05），见图1a（插页）。卵巢浆液性囊腺癌上皮细胞ELF3 mRNA表达水平高于正常卵巢上皮细胞（P＜0.05），见图1b（插页）。卵巢浆液性囊腺癌组织中ELF3蛋白表达阳性，正常卵巢组织中表达阴性，见图1c、d（插页）。

图1 卵巢浆液性囊腺癌组织与正常卵巢组织、卵巢浆液性囊腺癌上皮细胞与正常卵巢上皮细胞ELF3表达情况比较（a：卵巢浆液性囊腺癌组织与正常卵巢组织ELF3 mRNA表达水平比较；b：卵巢浆液性囊腺癌上皮细胞与正常卵巢上皮细胞ELF3 mRNA表达水平比较；c：卵巢浆液性囊腺癌组织ELF3蛋白表达阳性，免疫组化染色，×40；d：正常卵巢组织ELF3蛋白表达阴性，HE染色，×40）

2.3 不同临床病理特征患者卵巢浆液性囊腺癌组织ELF3 mRNA表达水平比较 不同FIGO等级、初始治疗效果、种族、组织学分级、肿瘤发生部位、血管侵犯、肿瘤残留的患者卵巢浆液性囊腺癌组织ELF3 mRNA表达水平比较差异均无统计学意义（均P＞0.05），年龄＞60岁的患者卵巢浆液性囊腺癌组织ELF3 mRNA表达水平低于年龄≤60岁的患者（P＜0.05），见图2。

图2 不同临床病理特征患者卵巢浆液性囊腺癌组织ELF3 mRNA表达水平比较（a：不同FIGO级别；b：不同病理分级；c：不同人种；d：不同年龄；e：是否侵犯淋巴结；f：是否侵犯血管；g：是否肿瘤残留；h：不同肿瘤发生部位；i：不同初始治疗效果）

2.4 ELF3 mRNA表达水平对卵巢浆液性囊腺癌的诊断价值分析 ELF3 mRNA表达水平诊断卵巢浆液性囊腺癌的ROC曲线显示AUC为0.988，最佳截断值为4.450，灵敏度为0.988，特异度为0.977，见图3。

图3 ELF3 mRNA表达水平诊断卵巢浆液性囊腺癌的ROC曲线

2.5 ELF3 mRNA高表达与低表达患者预后比较ELF3 mRNA低表达患者OS和DSS均优于低表达患者，差异有统计学意义（均P＜0.05），见图4。

图4 ELF3 mRNA高表达与低表达患者总生存曲线和疾病特异性生存曲线比较（a：总生存曲线；b：疾病特异性生存曲线）

2.6 ELF3在卵巢浆液性囊腺癌中可能参与的信号通路 GSEA富集分析结果显示，ELF3 mRNA表达相关的基因可能参与G蛋白偶联受体（G protein-coupled receptors,GPCR）与配体结合（标准化富集分数=-1.420，FDR=0.023，P＜0.05）和神经元系统（标准化富集分数=-1.463，FDR=0.023，P＜0.05）两条信号通路。

3 讨论

ELF3的表达情况在多种肿瘤疾病中可作为预后预测指标。例如，ELF3高表达与结肠癌的不良预后有关[5]，其mRNA是人表皮生长因子受体2阳性乳腺癌的不良预后的指标，并且作为癌基因发挥作用[6]，上皮细胞特异性转录因子1（epithelial cell-specific transcription factor 1,ESE1）/ELF3和NF-κB的一致上调也预示着前列腺癌患者的不良预后[7]。同时，ELF3也参与调控多种肿瘤疾病的进程。在非小细胞肺癌中，过表达的ELF3通过PI3K/Akt和ERK信号通路促进肿瘤细胞的增殖和转移[8]；在结肠癌中，ELF3激活Wnt/β-catenin信号通路，促进疾病进展[3]；在胆道癌中，ELF3直接抑制E盒结合锌指蛋白2并上调扣带蛋白的表达，ELF3的丢失导致细胞间连接减少和细胞运动性增强，促进肿瘤的进展，花生四烯酸5-脂氧合酶和CXC趋化因子配体16也是ELF3的直接靶标，在免疫反应中发挥调节作用[9]；Yachida等[10]对60例壶腹癌组织进行了全外显子组测序和DNA拷贝数分析，并进行了靶向测序，结果表明ELF3是壶腹癌的驱动因素；ESE1/ELF3与NF-κB亚基p65和p50相互作用，通过增强其核易位和转录活性以及诱导p50转录而驱动前列腺癌的进展[7]。说明ELF3是肿瘤疾病进程调节的重要因素，同时也是诊断和预后的潜在分子标志物。但ELF3在卵巢癌中的研究较为缺乏，基于以上原因，本研究对其在卵巢浆液性囊腺癌中的诊断、预后评估价值及可能参与的作用机制进行了探索。

本研究结果显示，ELF3 mRNA在卵巢浆液性囊腺癌组织中表达水平明显高于正常卵巢组织，说明ELF3 mRNA具有作为诊断卵巢浆液性囊腺癌的分子标志物的潜能，ROC曲线显示AUC为0.988，说明ELF3可以很好的区分肿瘤组织与正常组织，有望成为卵巢癌的生物标志物。分析患者临床病理特征与ELF3 mRNA表达水平的关系，发现年龄＞60岁的患者卵巢浆液性囊腺癌组织ELF3 mRNA表达水平低于年龄≤60岁的患者，这说明ELF3 mRNA高表达在年轻患者患病因素中可能更加重要。另外，ELF3 mRNA高表达患者较低表达患者预后差。

ELF3蛋白在卵巢浆液性囊腺癌组织中高表达，说明其可能参与该疾病的发生、发展，对此，本研究GSEA富集分析卵巢浆液性囊腺癌组织中ELF3表达相关的基因，结果显示ELF3可能参与GPCR配体结合和神经元系统两条信号通路，其中GPCR可以感应细胞外的分子并激活内部信号转导途径，最终激活细胞反应。已有多项研究表明GPCR参与的信号通路参与癌症的疾病进程[11-13]，尤其是在卵巢癌中，GPCR通过钙离子信号通路促进肿瘤细胞的迁移、侵袭和转移[14]。那么ELF3是如何参与GPCR信号通路，在这个过程中GPCR又是通过何种途径促进卵巢癌的进展，值得临床进一步探讨。结合并激活GPCR配体包括光敏化合物、气味、信息素、激素和神经递质等[15]，而ELF3相关基因也参与神经元系统信号通路。在卵巢浆液性囊腺癌中是否通过调节神经元系统来调控GPCR信号通路也值得临床进一步探讨。

综上所述，ELF3 mRNA表达水平在卵巢浆液性囊腺癌中具有较高的诊断、预后评估价值，高表达患者预后较差，并可能通过GPCR配体结合和神经元系统两条信号通路发挥作用。