反复胚胎种植失败人群母体全身因素对子宫内膜种植窗影响分析

白 云，钟兰萍，张婷婷，吴月蓉，李 蕾

（云南省第一人民医院/昆明理工大学附属医院生殖医学科，云南 昆明 650032）

在辅助生殖技术中，胚胎的质量和子宫内膜容受性这2 个因素类似于“种子”和“土壤”的关系，是妊娠成功的关键因素。随着体外受精-胚胎移植（in vitro fertilization -embryo transfer，IVF）中实验室技术的完善以及植入前遗传学检测技术（preimplantation genetic testing，PGT）的快速发展，目前在优质胚胎筛选方面已有较大进展，但是仍有一部分患者依然面临反复的优质胚胎无法成功植入（repeated implantation failure，RIF）的棘手状况。决定成功妊娠的另一重要因素子宫内膜容受性受到越来越多关注，子宫内膜容受性是指子宫内膜接受胚胎植入的能力，也表示内膜处于的一种状态。一般认为在规律的月经周期中，只有在周期的第20～24 天或黄体生成素峰（luteinizing hormone，LH）后第7 天（LH+7）或出现孕激素升高后5 d（P+5）子宫内膜具备对胚胎的接受能力[1]。因此，常把这个时期形象地称为胚胎着床的“窗口期”，顾名思义其仅在短期内开放，之后及时关闭胚胎便难以植入。越来越多的研究发现既往认为的种植窗恒定并非在所有患者中都成立，而表现为种植窗提前退后或缩短，随着以高通量测序技术为基础的基因转录组分析、全基因组关联研究等现代分子基因诊断技术的不断发展，结合机器学习所得的子宫内膜容受性检测（endometrial receptivity test，ERT）技术随之诞生[2]。ERT 技术能够准确区分容受前期、容受期、容受后期三个时期样本，容受前期和容受后期均被认为种植窗口移位。依据结果为给RIF 患者定制更准确的个体化胚胎移植（personalized embryo transfer，pET）方案。针对RIF 患者中可能影响种植窗的原因中，局部病理因素如宫腔内占位病变、输卵管积水、子宫腺肌症、慢性子宫内膜炎在行ERT 检测前已行相关检查排查且治疗。那么ERT 结果中发生种植窗移位的反复移植失败人群是否具有特定母体全身性因素影响子宫内膜容受性，目前尚无相关研究。本研究比较发生种植窗移位与非移位患者的临床指标以探讨种植窗移位的发病原因、应对策略。

1 资料与方法

1.1 研究对象及分组

回顾性分析2020 年12 月至2022 年1 月在云南省第一人民医院生殖医学科诊断为反复种植失败[3]并行ERT 检测的病例。纳入标准：（1）取卵年龄小于40 岁；（2）反复种植失败的患者，即既往≥3 次的移植失败，累积移植：优质D3 胚胎4～6 个或高评分囊胚（4BB 及以上囊胚）3 个及以上均失败；排除标准：（1）男女双方染色体核型异常；（2）有子宫内膜病变者（包括宫腔粘连、子宫内膜息肉、慢性子宫内膜炎、子宫内膜结核等）未治疗；（3）有输卵管积水且未行输卵管近端结扎者；（4）有粘膜下肌瘤未处理。根据ERT 结果分为容受期组和非容受期组。

1.2 内膜监测及手术时间安排

月经来潮10～12 d B 超监测卵泡及内膜厚度，若有优势卵泡发育监测至排卵，排卵+5 d 或出现LH 峰+7 d 安排内膜取材；若无优势卵泡发育，予激素替代周期，口服戊酸雌二醇（补佳乐，德国Bayer）2 mg，bid，用药14 d，内膜≥8 mm 时给予黄体酮阴塞（安琪坦，法国Capsugel）0.2 g，bid，及地屈孕酮口服（达芙通，荷兰Abbott）10 mg，bid，转化内膜6 d 后安排内膜取材。

1.3 内膜取材手术

手术当天行阴道分泌物、血常规检查。手术室患者取截石位，消毒铺巾，宫颈钳钳夹宫颈上下唇固定宫颈，探针探查宫深，顺子宫位置方向轻柔插入内膜取材取样器，待取样器底部达宫底处，左手握住并固定管套，右手握住手柄，快速向外拉管芯使宫腔形成负压吸取内膜组织。将取样管中的子宫内膜组织排除至无菌纱布上，挑选干净无血污染的内膜组织直接放入装有RNA 保存液的保存管，放入-20 ℃保存，联系送检取样。

1.4 观察指标

1.4.1 患者一般资料包括年龄、身体质量指数（body mass index，BMI）、不孕类型（原发不孕占比）、不孕年限。

1.4.2 胰岛素抵抗指数Homa IR=空腹血浆葡萄糖（mmol/L）×空腹血浆胰岛素（mIU/L）/22.5；Homa IR ＞2.69诊断为胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）[4]。

1.4.3 维生素D水平按照美国医学研究所制定的在健康人群中维生素 D 的标准[5]，维生素 D 缺乏指25-OHD＜ 50 nmol/L。

1.4.4 血栓前状态避开月经期行凝血酶原时间（PT），活化部分凝血活酶时间（APTT），凝血酶时间（TT），D-二聚体，纤维蛋白/纤维蛋白原降解产物（FDP），蛋白C、蛋白S 活性，抗凝血酶Ⅲ活性，血浆凝血因子Ⅴ活性，同型半胱氨酸检查，以上检测项目一项或多项阳性诊断血栓前状态（prethrombotic state，PTS）[6]。

1.4.5 抗磷脂抗体及抗核抗体抗磷脂抗体（antiphospholipid antibodies，aPLs，包括抗心磷脂抗体、抗β2-糖蛋白1 抗体，狼疮抗凝物），抗核抗体（antinuclear antibody，ANA）每12 周检测2次，2 次抗体阳性视为阳性组。

1.4.6 甲状腺功能促甲状腺激素（thyroid stimulating hormone，TSH）处于正常范围，而甲状腺自身抗体包括甲状腺过氧化物酶抗体（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）、甲状腺球蛋白抗体（thyroglobulin antibody，TGAb）阳性视为甲状腺自身免疫（thyroid autoimmunity，TAI）。

1.5 统计学处理

本研究统计分析采用SPSS（version 26），计量资料符合正态分布用（±s）表示。当方差齐时，独立样本t检验比较组间差异，当方差不齐时采用Cochran 矫正t检验比较组间差异。计数资料用频数和百分率表示，采用χ2检验进行分析。针对建模人群，采用Logistic 多元逐步回归筛选预测指标。P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 2 组患者一般临床资料比较

接受ERT 检测并得到结果的病例中，非容受期组19 例，容受期组38 例。2 组患者的年龄、BMI、原发不孕占比、不孕年限，内膜准备方案（替代周期占比）比较，差异无统计学意义（P＞0.05），见表1。

表1 2 组病例一般资料的比较[±s/n（%）]Tab.1 Comparison of general data of cases between the two groups [±s/n（%）]

表1 2 组病例一般资料的比较[±s/n（%）]Tab.1 Comparison of general data of cases between the two groups [±s/n（%）]

2.2 2 组患者内膜种植窗移位相关因素单因素分析

2 组患者间ANA 阳性、维生素D 缺乏发生率无统计学意义（P＞ 0.05），而IR 发生率、aPLs 阳性率、非容受期组明显高于容受期组（P＜ 0.05），见表2。

表2 2 组病例种植窗移位相关因素比较[n（%）]Tab.2 Comparison of related factors of implant window displacement between two groups [n（%）]

2.3 内膜种植窗移位相关因素Logistic 回归分析

将单因素分析中IR、aPLs 阳性（P＜ 0.05）及TAI（P=0.056），PTS（P=0.067）进行Logistic 多因素回归分析，最终IR、易栓症、TAI 阳性进入回归方程。三者为内膜种植窗移位的独立危险因素，见表3。

表3 影响种植窗移位的Logistic 回归分析Tab.3 Logistic regression analysis of influencing the displacement of planting window

3 讨论

目前有研究认为，反复自然流产和反复种植失败两个综合征可能有共同的发病机制[7]，免疫学因素、血凝因素、女性生殖道解剖结构异常以及内分泌异常被认为是自然流产中最重要的4 种母体病因[8]。生殖道解剖异常易于诊断，但自身免疫因素、血凝因素以及内分泌异常在反复种植失败人群中所起的作用已逐渐引起重视，而上述因素是否通过对种植窗产生影响从而影响胚胎着床目前尚无研究。笔者的研究发现胰岛素抵抗、血液高凝状态和甲状腺自身免疫是种植窗移位的危险因素。

3.1 胰岛素抵抗对子宫内膜种植窗影响

胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）是指外周组织对胰岛素敏感性下降产生对葡萄糖的利用率降低的结果，为达到正常血糖水平机体代偿性分泌胰岛素，导致血液胰岛素水平过高，即高胰岛素血症。既往的研究认为IR 对IVF 结局的影响主要体现在卵母细胞质量受损[9-11]，而本研究发现胰岛素抵抗是种植窗移位的危险因素之一，Chang 等[12]通过比较合并IR 的多囊卵巢综合征与不合并IR 的多囊卵巢综合征接受IVF 助孕的治疗结局，发现2 组间获卵数、卵子成熟度、卵裂率和胚胎质量差异无统计学意义，但胚胎种植率、临床妊娠率合并IR 组明显低于不合并IR 组。有研究发现，胰岛素抵抗、高雄激素与子宫内膜容受性标志物如αvβ3 整合素、同源框基因A10（homeoboxA10，HOXA10）、胰岛素样生长因子结合蛋白（IGFBP-1）低表达有关[13-14]。分析其原因可能存在以下因素，高胰岛素血症会下调肝脏IGFBP-I，导致循环中游离IGF-I 升高。上述两者水平升高可抑制子宫内膜间质分化的正常进程即子宫内膜蜕膜化，从而影响滋养层的侵袭和生长、免疫调节网络与细胞因子环境[15]。近年来，子宫内膜局部IR 逐渐受到关注，妊娠建立的条件包括具有容受性的子宫内膜以及内膜胚胎的交互作用，在这个过程中葡萄糖摄取以获得能量[16]是前提。子宫内膜局部IR 由于胰岛素受体底物磷酸化、PI3K/蛋白激酶 B （Akt） 信号通路以及胰岛素敏感的转运蛋白GLUT-4 表达三者异常，由此发生的IRS/PI3K/Akt/G LU T-4 通路受损破坏蜕膜化过程能量稳态影响子宫内膜的葡萄糖利用[17]。以上可能是胰岛素抵抗干扰正常种植窗开放，导致种植窗移位的原因。

3.2 血栓前状态对子宫内膜种植窗影响

本研究单因素分析提示容受期与非容受期血栓前状态比率无统计学差异，但放入多因素回归分析则提示血栓前状态是内膜种植窗移位的危险因素。凝血系统异常会导致出血或血栓形成，血栓形成前的高凝状态称为血栓前状态（prethrombotic state，PTS）[6]。近年来，越来越多的研究支持RIF 与PTS 有关[18]，PTS 可能在一定程度上影响凝血-纤溶系统的平衡，导致凝血功能增强。Bellver 等发现[19]，凝血因子缺陷发生率在RIF 病例中较正常生育妇女显著增高，亦有系统评价提示[20]RIF 与凝血因子缺陷显著相关。Wen[21]研究发现血栓前状态在黄体中期子宫内膜动脉血流得阻力明显高于对照组，并且由于高凝状态，子宫的血流速度处于高阻力状态，从而导致内膜血流灌注不足，对内膜容受性产生影响，这也许是血栓前状态影响内膜种植窗的主要原因。基于上述，Yang 等[22]建立了预测中国女性RIF的凝血检查指标模型，发现凝血参数包括PT、APTT、TT 和AA 诱导的血小板聚集是RIF 的预测指标，强调了抗凝治疗降低RIF 风险的潜力。

3.3 自身免疫性甲状腺疾病对子宫内膜种植窗影响

临床甲状腺功能障碍，主要是出现甲状腺自身抗体，包括甲状腺过氧化物酶抗体（thyroid peroxidase antibody，TPOAb）、甲状腺球蛋白抗体（thyroglobulin antibody，TGAb）。既往不少研究发现：不孕症女性人群中，TAI 发病率较对照组增加[23-24]。TAI 对辅助生殖结局影响研究结果目前存在较大争议，Patriza 等[25]研究发现：TAI 组患者接受辅助生殖治疗受精率、优胚率、临床妊娠率均低于对照组，推测卵泡液中就已存在的甲状腺抗体干扰了女性生殖。2016 年一项系统评价分析提示TAI 在辅助生殖中不影响获卵、受精、胚胎形成，而是增加了流产率[26]，综上TAI 对于内膜容受性影响并不明确。2017 年的一项研究[27]通过流式细胞学技术对比了正常人群和甲状腺功能正常TAI 女性患者之间外周血单核细胞表型，发现TAI 组外周血中先天免疫的Th1 型变化，升高的NK 和NKT 样细胞比率和增强的天然细胞毒性解释了可能对妊娠结局包括内膜容受性具有负面影响的免疫状态。

综上所述，IR、PTS、TAI 是子宫内膜种植窗移位的母体全身性危险因素，该结果对于RIF 的预防和治疗提供了新的思路和方向。同时，本研究存在一定的局限性，因研究样本例数的限制，使部分结果缺乏统计学差异，后期拟进一步增加研究例数扩大研究范围，完善相关参数的比较。