CircRNA EZH2 通过调控miR-30c-5p 促进前列腺癌细胞增殖和迁移

赵 斌 ，段元鹏 ，张国颖 ，毕城伟 ，杨李波 ，施致裕 ，杨 勇 ，张建朋 ，高 婷

（1）云南省肿瘤医院泌尿外科，云南 昆明 650118;2）云南财经大学校医院，云南 昆明 650021）

前列腺癌是全球男性中最常见的癌症之一[1]，转移性前列腺癌的5 a 生存率仅为31%，且复发及晚期前列腺癌通常被认为是无法治愈的[2]。在世界较发达地区，前列腺癌的发病率最高[3]，相比之下，亚洲男性的发病率低于全球水平，但前列腺癌仍然是影响男性健康的一个重大医学问题。因此，阐明前列腺癌的基因机制，寻找新的诊断和治疗的生物标志物至关重要。

CircRNA 是一类内源性非编码RNA，源自前体mRNA 反向剪接，其通过3' 和5' 端反向剪接形成共价闭合结构。近年来，在各种生物体中已鉴定出数以千计的circRNA，并发现他们在许多疾病中发挥着关键作用，尤其是癌症，circRNA可以参与癌证的诸多病理生理过程，包括细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡[4-6]。然而，目前有关circRNA 在前列腺癌中的报道较少。Wen 等[7]发现circRNA EZH2 与胶质瘤细胞增殖、迁移和侵袭相关。但circRNA EZH2 在前列腺癌中的作用和机制尚不清楚。

微小RNA（miRNA）是一类长度约22 个核苷酸的非编码小RNA，在调节细胞周期、细胞增殖和凋亡以及肿瘤发展中起着关键作用。MiR-30c-5p 是多种恶性肿瘤进展的关键调控基因，在非小细胞肺癌[8]、大肠癌[9]、胰腺癌[10]等疾病中均有报道。CircRNA 和miRNA 的相互作用在癌症发生和发展中起重要作用。本研究旨在为解释circRNA EZH2 调控miR-30c-5p 在前列腺癌中的作用机制提供理论依据，同时将为前列腺癌的诊断和治疗提供新的生物标志物和靶点。

1 材料与方法

1.1 细胞系及主要试剂

人前列腺癌细胞系LNCaP（货号CL-0143）、人正常前列腺上皮细胞RWPE1（货号CL-0200）、人胚肾细胞HEK-293（货号CL-0001）购自武汉Procell 公司；RPMI1640 培养基、青链霉素双抗、谷氨酰胺、胎牛血清、胰酶均购自美国Gibco 公司；CCK-8 试剂盒购自上海东仁化学公司，划痕插件购自德国IBIDI 公司；riboFECT™ CP 转染试剂购自广州锐博生物公司；circRNA EZH2 的siRNA（si-circRNA EZH2）、siRNA 阴性对照（si-NC）、miR-30c-5p inhibitors 序列由广州锐博生物公司合成；Trizol 试剂盒购自美国 Life technologies 公司，FastKing RT Kit （With gDNase）FastKing cDNA 第一链合成试剂盒购自北京天根公司，ECL 显影液购自美国Millipore 公司；RIPA 裂解液、BCA 蛋白浓度测定试剂盒、SDSPAGE 蛋白上样缓冲液均购自碧云天；双荧光素酶报告基因检测试剂盒、JAK1、PI3K 抗体购自英国abcam 公司；GAPDH 抗体、HRP 标记的IgG二抗购自美国CST 公司。荧光素酶载体购自上海海吉浩格生物科技有限公司；Lipofectamine®3000、购自美国Thermo 公司；RNase R 购自广州吉赛公司。

1.2 生物信息学分析

在癌症基因组图谱（TCGA）[11]数据库（https://portal.gdc.cancer.gov/）中获取数据对前列腺癌旁和肿瘤组织中的circRNA EZH2 表达差异进行分析，中位数作为阈值区分高低表达。用Kaplan-Meier曲线检测circRNA EZH2 与前列腺癌进展的时间相关性，起点事件为手术切除；终点事件为死亡；删失数据为失访、死于其他疾病、观察结束时病人尚存活。Logrank 法检验及单因素预后分析，Cox 风险比例模型多因素预后分析。用starBase v2.0 筛选下游靶基因。

1.3 细胞培养及转染

用含10% FBS、1%双抗和1%谷氨酰胺的RPMI 1640 培养基，于37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养LNCaP 细胞。待细胞汇合度达80%时，将细胞接种至6 孔培养板，每孔接种5×104个细胞，过夜培养。细胞分为：对照组、阴性对照组、si-circRNA EZH2 组、si-circRNA EZH2 和miR-30c-5p inhibitors 联合应用组。参照riboFECT™CP 转染试剂说明书进行转染。转染前，对照组更换为无双抗的RPMI 1640 培养基；阴性对照组更换为含si-NC（50 nM）的RPMI 1640 培养基；sicircRNA EZH2 组更换为含si-circRNA EZH2（50 nM）的RPMI 1640 培养基；si-circRNA EZH2和miR-30c-5p inhibitors 联合应用组更换为含sicircRNA EZH2（50 nM）和miR-30c-5p inhibitors的RPMI 1640 培养基，继续培养48 h。

1.4 CCK-8 法检测细胞增殖能力

接种LNCaP 细胞至96 孔板内，另接种3 孔LNCaP 细胞正常培养作为CCK-8 对照组，每孔接种2 500 个细胞，每组3 个孔重复。RPMI1640培养基继续培养48 h 后，每孔加入10 µLCCK-8试剂，在培养箱内孵育2 h 后，于酶标仪450 nm波长下检测吸光度。

1.5 划痕实验检测细胞迁移能力

接种LNCaP 细胞至IBIDI 插件内，每孔接种5×104个细胞，使用RPMI 1640 培养基在37 ℃、5% CO2恒温培养箱中培养。待汇合度达80%时，移除划痕插件，于0 h 和24 h 时间点观察划痕宽度，在倒置显微镜下拍摄记录。

1.6 RT-qPCR 检测细胞中相关 circRNA、miRNA 及JAK1 的mRNA 表达水平

按照TRIZOL 法提取LNCaP 细胞中的总RNA，测量RNA 浓度后，逆转录合成cDNA 第一条链。根据qPCR 试剂盒说明书对cDNA 进行扩增。引物序列见表1。反应体系为10 µL，反应条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 30 s，共进行45个循环。以GAPDH 作为circRNA EZH2 和JAK1的内参，以U6 作为miR-30c-5p 的内参，运用2-ΔΔCt法进行定量分析。

表1 RT-qPCR 所需引物序列Tab.1 Primer sequences

1.7 Western blot 实验检测细胞中JAK1 和PI3K 的表达水平

JAK1 信号在癌症中常被激活[12]，于是笔者检测了circRNA EZH2 对其是否有调控。加入RIPA 裂解液和蛋白酶抑制剂，从LNCaP 细胞中提取总蛋白，用BCA 蛋白浓度测定试剂盒进行定量。样品中的蛋白采用SDS-PAGE 分离并湿转移至PVDF 膜上，BSA 封闭后加入JAK1（1∶1 000）和PI3K（1∶1 000）一抗，在4 ℃下孵育过夜。二抗（1∶2 000）室温孵育1 h，使用ECL 显影液曝光。使用Image J 软件测定灰度值。

1.8 双荧光素酶报告基因实验

将circRNA EZH2 的野生型（WT）或突变型（MUT）3’-UTR 克隆到pGL3 启动子荧光素酶载体。按照制造商说明，使用Lipofectamine®3000用miR-30c-5p mimic 和circRNA EZH2 或其突变体转染HEK-293 细胞。48 h 后通过双荧光素酶报告基因检测试剂盒检测荧光素酶活性。

1.9 RNase R 处理

总RNA（2 µg）在37 ℃下与3 U/mg RNase R共同孵育15 min。qRT-PCR 检测circRNA EZH2的表达。

1.10 统计学处理

通过 Graph-Pad Prism 9 软件（GraphPad Software，San Diego，CA） 进行 Kolmogorov-Smirnov 检验数据的正态性。正态分布的连续性变量均以平均数±标准差（mean±SD）表示，并通过Graph-Pad Prism 9 软件进行统计分析。组间比较采用单因素方差分析，如有差异进一步用Tukey's 检测两两比较，P＜ 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 circRNA EZH2 在前列腺癌中高表达

首先通过TCGA 数据库评估了circRNA EZH2 在499 例前列腺癌肿瘤样本和52 例癌旁组织中的表达，肿瘤样本中位数为2.504，癌旁组织中位数为1.483，发现circRNA EZH2 在前列腺癌组织中显著高表达（P＜ 0.01，图1A）。此外，对TCGA 数据库中的前列腺癌样本进行Kaplan-Meier 分析结果显示，前列腺癌患者中，circRNA EZH2 表达水平较高的患者（250 例）相较于circRNA EZH2 表达水平较低的患者（249 例）生存率更低（图1B）。RT-qPCR 结果显示，circRNA EZH2 在前列腺癌LNCaP 细胞中的表达较人前列腺上皮细胞RWPE1 中更高（P＜ 0.001，图1C）。这些数据表明circRNA EZH2 在前列腺中过表达，并且circRNA EZH2 高表达与前列腺癌的进展和不良预后相关。

图1 CircRNA EZH2 在前列腺癌中高表达Fig.1 circRNA EZH2 in prostate cancer

2.2 CircRNA EZH2 环状结构的验证

通过RNase R 酶切实验，证实了circRNA EZH2 具有高度保守的环状结构，结果显示，线性EZH2 被RNase R 酶切，而circRNA EZH2 没有被酶切（P＜ 0.001），见图2。

图2 qRT-PCR 检测LNCaP 细胞总RNA 经RNase R处理后circRNA EZH2 及线性EZH2 的表达Fig.2 qRT-PCR detected the expression of circRNA EZH2 and linear EZH2 after RNase treatment total RNA from LNCaP cells

2.3 敲降circRNA EZH2 抑制前列腺癌细胞增殖和迁移

在LNCaP 细胞中通过转染si-circRNA EZH2成功下调circRNA EZH2 的表达，且转染si-NC未改变circRNA EZH2 的表达（P＜ 0.000 1，图3A）。CCK-8 检测表明，转染si-circRNA EZH2 可抑制LNCaP 细胞的增殖（P＜ 0.000 1，图3B），使其生长密度降低（图3D）。此外，划痕实验表明，转染si-circRNA EZH2 后，LNCaP 细胞的迁移明显减弱（P＜ 0.000 1，图3C、3E）。以上数据表明，circRNA EZH2 促进LNCaP 细胞的增殖和迁移。

图3 CircRNA EZH2 对前列腺癌细胞增殖和迁移的影响Fig.3 The effects of circRNA EZH2 on proliferation and migration of prostate cancer cells

2.4 circRNA EZH2 靶向调控miR-30c-5p

通过CircBase、StarBase 等数据库进行预测发现circRNA EZH2 具有hsa-miR-30c-5p 结合位点，推测circRNA EZH2 可能与miR-30c-5p 有相互作用（图4A）。双荧光素酶报告基因实验显示，miR-30c-5p 显著降低了WT-circRNA EZH2 的荧光素酶活性（P＜ 0.000 1，图4B）。通过RT-qPCR实验对miR-30c-5p 抑制剂效果进行验证，结果显示与对照组和过表达组相比，miR-30c-5p 抑制剂显著降低了miR-30c-5p 的表达（P＜ 0.001，图4C）。RT-qPCR 实验显示，在转染si-circRNA EZH2 的LNCaP 细胞中miR-30c-5p 表达显著上调，转染si-circRNA EZH2 和miR-30c-5p 抑制剂后，miR-30c-5p 的表达与仅转染si-circRNA EZH2 组相比明显降低（P＜0.000 1，图4D）。而circRNA EZH2 的表达受miR-30c-5p 抑制剂影响不明显（P＜ 0.000 1，图4E），猜测miR-30c-5p 可能是circRNA EZH2 的下游靶基因。

图4 CircRNA EZH2 靶向miR-30c-5pFig.4 CircRNA EZH2 targeted miR-30c-5p

2.5 circRNA EZH2/miR-30c-5p 轴调控前列腺癌细胞增殖和迁移

CCK-8（P＜ 0.000 1，图5A）和细胞培养显微镜观察（图5B）显示，miR-30c-5p 抑制剂的加入下调了转染si-circRNA EZH2 对LNCaP 细胞增殖的抑制，且细胞增殖能力恢复至较control 组和si-NC 组无显著差异。此外，LNCaP 细胞的迁移能力也在抑制miR-30c-5p后恢复（P＜ 0.000 1，图5C、5D）。上述实验结果说明circRNA EZH2可以通过调控miR-30c-5p 的表达来调控LNCaP细胞增殖和迁移。

图5 CircRNA EZH2 调控miR-30c-5p 轴对前列腺癌细胞增殖和迁移的影响Fig.5 CircRNA EZH2 regulated cell proliferation and migration via miR-30c-5p in prostate cancer cell

2.6 circRNA EZH2 调控JAK1 和PI3K 信号通路

RT-qPCR 结果显示（P＜ 0.000 1，图6A），sicircRNA EZH2 的转染使JAK1 的表达显著下调，而si-circRNA EZH2 转染后加入miR-30c-5p 抑制剂使JAK1 的表达相较于仅转染si-circRNA EZH2 组显著上调，Western blot 实验也得到同样的结果（P＜ 0.000 1，图6B、6C）。Western blot 结果显示，转染si-circRNA EZH2 后PI3K 的表达下调，而同时转染si-circRNA EZH2 和miR-30c-5p 抑制剂后PI3K 的表达水平高于仅转染sicircRNA EZH2 组（P＜ 0.005，图6B、6D）。这表明PI3K 信号与circRNA EZH2 的高表达正相关，且受miR-30c-5p 的负调控。

图6 CircRNA EZH2 对JAK1 和PI3K 的调控Fig.6 CircRNA EZH2 regulated JAK1 and PI3K

3 讨论

CircRNA 丰富而保守，而且与大多数其他线性RNA 相比，circRNA 更加稳定，因此circRNA可作为有效的生物标志物和治疗靶点。目前关于circRNA EZH2 的研究较少，在已有报道中，circRNA EZH2 能通过NF-κB 通路调节猪肠上皮细胞的炎症反应[13]；circRNA EZH2 在胶质瘤中可作为miR-1 265 的海绵调控DDAH1 和CBX3 的表达[14]。因此，circRNA EZH2 的失调可能在调节人类癌症的进展中起重要作用。本研究中，笔者发现circRNA EZH2 在前列腺癌组织中高表达，并证明circRNA EZH2 在前列腺癌细胞中过表达且与癌症发展相关。Kaplan-Meier 分析表明，circRNA EZH2 过表达与前列腺癌患者的生存率降低显著相关。功能缺失实验表明，circRNA EZH2在前列腺癌细胞中促进其增殖和迁移。在机制上，circRNA EZH2 通过调控miR-30c-5p 来调控JAK1 的表达并激活PI3K 信号通路。这些发现为了解circRNA EZH2 在前列腺癌进展中的致癌作用提供了见解，并表明circRNA EZH2 可能是前列腺癌预后和治疗的生物标志物。

已经证明，circRNA 可以和miRNA 相互作用，以发挥生物学功能。笔者的结果证明，circRNA EZH2 能够调控miR-30c-5p 的表达，进而调控下游基因JAK1 的表达，促进前列腺癌生长。JAK1是Janus 激酶家族成员之一，在多种类型的细胞中表达。它在许多肿瘤，包括前列腺癌的发展中有重要作用，并在转移性癌症进展中起关键作用[12]。在笔者的实验中，沉默circRNA EZH2 能下调JAK1的mRNA 和蛋白表达，这表明circRNA EZH2 可能作为一种JAK1 抑制剂在前列腺癌的治疗中发挥作用。

本研究本研究的另一个重要发现是circRNA EZH2 可以激活磷脂酰肌醇3-激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）信号。PI3K 的信号传导与人类肿瘤进展、肿瘤微血管密度增加以及癌细胞的趋化性和侵袭潜力显著相关，PI3K 的突变在常见的人类癌症中经常发生[15]，被认为是癌症治疗的关键靶点之一。笔者推测circRNA EZH2 在前列腺癌中的调控作用可能与PI3K 信号有关，并在LNCaP 细胞中检测了circRNA EZH2 是否对PI3K 信号有影响。PI3K 信号通路在许多癌症的发展中起着关键作用，在前列腺癌中也经常被异常激活，尤其是在转移性前列腺癌中[16]。PI3K 信号的过度激活促进了前列腺癌的增殖，转移和复发。例如，miR-133a-3p 下调激活的PI3K 信号能促进前列腺癌骨转移[17]。雄激素剥夺疗法是治疗前列腺癌的一种主要方法，然而，大多数患者会对雄激素剥夺产生抵抗力，从而导致肿瘤持续生长，患者死亡率上升[18]。PI3K 信号通路的激活能够重新连接雄激素受体的信号传导，从而减少肿瘤对雄激素的需求，以促进前列腺癌生长[19]。笔者发现circRNA EZH2 的抑制下调了PI3K 信号的表达，相反的是，miR-30c-5p 的抑制激活了PI3K 信号。这些结果阐明了circRNA EZH2 可作为PI3K 通路的调节剂，并可作为干预前列腺癌的潜在靶标。

总而言之，本研究发现circRNA EZH2 在前列腺癌组织中上调，并有助于前列腺癌进展。circRNA EZH2 的缺失可影响miR-30c-p 的功能，下调JAK1 表达并干扰PI3K 信号通路，从而抑制前列腺癌细胞的增殖和迁移。综上，circRNA EZH2 可能作为前列腺癌过程中的致癌基因，为前列腺癌的诊断和治疗提供潜在靶标。